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微生物果胶酶研究进展及其在果蔬加工中的应用马蕾(四川大学生命科学学院生物技术专业)摘要:果胶酶在工业生产领域中是一种重要的新型酶类,在果蔬加工、饲料、纺织和制造工业中应用非常广泛。近年来研究进展较为迅速。本文介绍了果胶酶的微生物来源,从果胶酶的分类、理化性质、微生物果胶酶的酶学性质及在果蔬加工应用方面加以论述。关键词:果胶酶;酶活测定方法;果蔬加工前言果胶质广泛存在于高等植物中,是植物细胞胞间层和初生壁的重要组成成分,植物的细胞组织间起“黏合”作用。近几年来,果胶质的生物降解日益引起国内外学者的广泛关注。能够分解果胶质的酶被称作果胶酶(pectinase),它广泛存在于各种微生物中,细菌、真菌和放线菌都能产生相关酶类。果胶酶类的应用领域非常广泛,不仅可用于食品工业如水果加工及葡萄酒生产等方面,还广泛应用于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理和饲料等行业中。果胶酶主要分为原果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、裂解酶和果胶酯酶等几大类,研究果胶酶各组分的性质,有利于果胶酶的单一酶种的开发利用。同时微生物果胶酶的分子生物学研究将有助于更合理地利用果胶酶。1、果胶简介果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合而成的多糖链,常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链,游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子,特别是与硼化合物结合在一起[1]。它存在于所有的高等植物中,沉积于初生细胞壁和细胞间层,在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白(extensin)[2]相互交联,使各种细胞组织结构坚硬,表现出固有的形态.果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同,其大致的结构简图如图1所示,总体可分为光滑区(smoothregion)和须状区(hairyregion)两部分,主要由HGA、RG-I和RG-II三个结构区域构成,其中RG-II常以二聚体的形式存在.同其它植物多糖一样,果胶也是多分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的,也具有一定的相对分子质量分布。2、果胶酶分类从广义上讲,果胶酶可以被分为3种类型:①原果胶酶:可以把不溶于水的原果胶分解为可溶于水的高聚合体果胶;②果胶酯酶:脱去果胶中的甲氧基基团,促使果胶的脱甲酯作用;③解聚酶:促使果胶中D-半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键的裂解。近来人们提出了更详细分类方法为[3]:原果胶酶(protopectinases)、多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases)、裂解酶(pectinlyases,PL)、果胶酯酶(Pectinesterase,PE)。2.1原果胶酶Briton等人[4]把能够促使原果胶溶解的酶命名为原果胶酶。根据其作用机理分为两种类型:A型原果胶酶与B型原果胶酶。前者主要作用于原果胶的内部的多聚半乳糖醛酸区域。而后者主要作用于外部的连接聚半乳糖醛酸链和细胞壁组分的多糖链。2.2多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases)聚半乳糖醛酸酶是在有水环境下促进聚半乳糖醛酸链水解的一种果胶酶,应用最为广泛。根据水解作用机理不同,它可以分为内切聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)和外切聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.67)。外切酶又可以划分两种类型:一种是真菌外切聚半乳糖醛酸酶,它的终产物是单体半乳糖醛酸;另一种是细菌外切聚半乳糖醛酸酶,它的终产物是二聚体的半乳糖醛酸。2.3裂解酶(pectinlyases,PL)裂解酶(反式消去酶)是通过反式消去作用裂解果胶聚合体的一种果胶酶,裂解酶在C-4位置上断开糖苷键,同时从C-5处消去一个H原子从而产生一个不饱和产物。根据其作用机理以及作用底物的不同,裂解酶可以划分为:①内切聚半乳糖醛酸裂解酶(EndoPGL,E.C.4.2.2.2);②外切聚半乳糖醛酸裂解酶(ExoPGL,E.C.4.2.2.9);③内切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(EndoPMGL,E.C.4.2.2.10);④外切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(ExoPMGL)。3、果胶酶产生菌目前国内外研究和应用较多的果胶酶产生菌是细菌和霉菌[5,6],也有链霉菌产生果胶酶的报道[7]。在细菌中,欧文氏杆菌(Erwiniasp.)、芽孢杆菌(Bacillussp.)、节杆菌(Arthrobactersp.)和假单胞杆菌(Pseodomonassp.)都产生果胶酶。嗜碱性芽孢杆菌属和欧文氏杆菌属主要用于在苎麻和红麻的脱胶、生物制浆及污物的处理软化等方面,应用前景可观,受到较多的关注和研究。已见报道的产果胶酶的霉菌种类大约包括20个属,如曲霉属(Aspergillussp.)、灰霉菌属(Botrytissp.)、镰孢菌属(Fusariumsp.)、炭疽菌属(Colletotrichumsp.)、核盘菌属(Scletoriumsp.)和玉圆斑菌属(Cochliobolussp.)等。目前,黑曲霉、根霉和盾壳霉作为产果胶酶的菌株已经商品化。国内外对霉菌发酵产果胶酶的研究主要集中在曲霉属中,而曲霉属中研究最多的是黑曲霉。其原因是,果胶酶被广泛应用于食品工业中,如用于果汁、果酒及中药营养液的深加工等,使得产品质量和外观得以改善,而生产食品酶制剂的菌株必须是安全菌株。黑曲霉分泌的胞外酶系较全,不仅可以产生大量果胶酶,而且黑曲霉属于安全菌株。另外,黑曲霉产生的果胶酶最适pH值一般在酸性范围内,这也是其被应用于食品工业行业中的原因之一。A型原果胶酶主要来源于酵母及酵母状真菌的发酵液中。研究人员已经从KluyveromycesfragilisIFO0288.GalactomycesreeseiL.和Trichosporonpenicilla-tumSNO3[8]中分离出了原果胶酶.依次称为原果胶酶-F,-L和-S(PPase-F.-L.-S),另外从BacillussubtilisIFO12113,B.subtilisIFO3134和Trametesp.菌株中分离出了B-型原果胶酶[8],依次称为原果胶酶-B,-C和-T(PPase-B,-C和-T)。内切聚半乳糖醛酸酶广泛分布于真菌和细菌中,在一些高等植物和寄生于植物的线虫中我们也发现了此种酶。据报道,现在已经在许多微生物的菌体中发现了这种内切酶,包括Aureobasidiumpullulans,RhizoctoniasolaniKuhn,Fusariummoniliforme,Neurosporacrassa,Rhizopusstolonifer,Aspergillussp,Thermomyceslanuginosus,Peacilomycesclavisporus等。科研人员已经在大量的微生物种类中,对内切聚半乳糖醛酸酶进行了克隆复制,在遗传学方面进行了大量的研究。相对而言,产生外切聚半乳糖醛酸酶的微生物较少。已经报道的产生外切活性酶的微生物有:Erwiniacarotovora,Agrobacteriumtumefaciens,Bacteroidesthetaiotamicron,E.chrysanthemi,Altemariamali,Fusariumoxysporum,Ralstoniasolanacearum,Bacillussp.等[9-11]。聚半乳糖醛酸裂解酶(PGLs)可以由多种细菌和一些致病性的真菌产生,内切聚半乳糖醛酸裂解酶比外切聚半乳糖醛酸裂解酶要丰富。可以从腐烂食物中的细菌和真菌中分离到PGLs。据报道,从Colletotrichumlindemuthionum,Bacteroidesthetaiotaomicron,Erwiniacartovora,Amucalasp,Pseudomonassyringaepv.Glycinea,Colletotrichummagna,E.chrysanthemi,Bacillussp,Bacillussp.DT-7,C.gloeosporioides等[12,13]菌株中可以分离到此种酶。相比之下关于聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGLs)的产品却鲜于报道,仅有少数报道指出我们可以从As.pergillusjaponicus,Penicilliumpaxilli,Penicilliumsp.,Pythiumsplendens,Pichiapinus,Aspergillussp.,Thermoascusauratniacus中分离到此种酶[13-15]。3、果胶酶的理化性质3.1果胶酶活力检测方法掌握可靠的酶分析定量方法是开展果胶酶研究工作的重要前提。果胶酶的测定方法很多,各具特点,且酶活单位的定义不同,要根据不同情况加以选择对比。常用的酶活力测定方法有:3.1.1滴定法滴定法主要用于测定果胶酯酶的活力,根据该酶作用机制,采用滴定羧基来评价酶活。果胶酯酶的活力还有一种测定方法,即,通过气相色谱或液相色谱仪定量分析甲醇,根据甲醇的生成量来评价酶活,此方法比较精确但要求较高。3.1.2黏度下降法黏度下降法基于果胶物质在酶的作用下大分子降解伴随底物溶液黏度下降这一事实,以底物黏度下降的百分比来评价酶活。该方法所测定的酶活性,主要是反映内切酶酶活。3.1.3脱胶作用时间法该方法根据果胶物质在未被酶解之前以及在酶解反应的不同时期能在异丙醇溶剂中形成大小不等的胶团而判断酶的活性。该方法最能反映内切水解酶和内切裂解酶两种酶在实验条件下的综合能力。3.1.4还原糖测定法无论是内切还是外切果胶酶的作用,长链果胶分子的糖苷键断裂结果都产生还原端基。这些还原端基的生成量。可用来表示酶活性。最为常用的为DNS(3,5-二硝基水杨酸)法。3.1.5235nm处紫外吸收测定法这是专门测定裂解酶活力的一种方法。裂解酶作用于底物经历一个β-消除反应,使底物生成非还原末端C4、C5之间带有双键的产物,该产物在235nm处产生最大紫外吸收,酶活性测定正是根据该反应产物而设计的。3.2微生物果胶酶的酶学性质国内外科学家利用层析、电泳等手段对果胶酶的酶学性质进行了研究,明确了一些果胶酶的分子量、动力学性质及其影响因素。常用果胶酶纯化方法有:硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、离子交换层析以及凝胶过滤色谱等。果胶酶分子量一般在20kD~60kD之间,单体存在,个别以多聚体形式存在,如海栖热袍菌果胶酸裂解酶分子量为115.2kD,结构为四聚体。通常果胶酶活性范围在pH3.0~9.0,等电点pH4.0~9.0。其中,最适pH4.0~6.5的为水解酶,其作用不需要Ca2+参与。而裂解酶的作用需要Ca2+参与,最适pH为8.0~10.0。不同菌种所产果胶酶性质有所不同。Alana等人采用了半固体和液体发酵两种不同的培养方式,采取凝胶过滤色谱和层析聚焦两种生化手段对Penicilliumitalicum生产果胶酶进行研究,发现两种培养方式产生的酶分子量、等电点、Km都相同,分别为22kD、8.6、3.2mg/ml。最适作用温度50℃,最适pH6.0~7.0,远低于细菌果胶裂解酶最适pH,Co2+、Cu2+、Fe2+是其抑制剂。不同的是:该菌株液体发酵分泌果胶裂解酶可在低pH条件下由高酯果胶诱导。半固体发酵产生的果胶裂解酶活力高,专一性较差。BruhlmannF对无枝酸菌果胶裂解酶进行了纯化鉴定。该酶分子量为31kD,最适pH为l0.25,等电点为10.0,在pH6.0~8.0内酶活稳定,Ca2+是其保持活性的必需离子。并对该酶降解果胶的产物进行了研究,先通过体积排阻色谱分离果胶酶降解产物,然后由快原子轰击电离质谱确定其组分,结果显示酶解反应初期就产生了大量的不饱和寡半乳糖醛酸,证明了该酶是内切酶。Saccharomyceseerevisiae的基因PGL1-1编码的聚半乳糖醛酸酶,分子量42kD,最适作用温度25℃,最适作用pH4.0,在pH3.0~5.0内酶活稳定,pH3.0时酶活保留80%,耐酸能力极强。4、果胶酶的生物学研究4.1果胶酶的理化性质果胶酶是作用于果胶质的一类酶的总称,主要功能是通过裂解或β消去作用切断果胶质中的糖苷键
本文标题:微生物果胶酶研究进展
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