微生物的分离培养

实验14、15、16微生物的分离计数实验目的、要求（1）学习并掌握细菌、放线菌、真菌等微生物的稀释分离计数等技术。（2）了解3大类微生物的培养条件和培养时间。（3）学习平板菌落计数法。以细菌为例实验原理纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。分离：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法。纯种（纯培养）：一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌种及纯化被污染的菌种等。土壤是微生物的大本营，混杂着大量的微生物，从中分离可得到只含有这一种微生物的纯培养。稀释分离法有倾注法和涂布法两种；菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。要获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间详见实验指导书表格。细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，在30-37℃温度下培养1-2天。平板菌落计数——活菌计数0.90.10.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.9ml分离纯化基本流程实验仪器、材料实验材料菌源:土样10g;培养基牛肉膏蛋白胨培养基;实验仪器与用具1)超净工作台、恒温培养箱、酒精灯2）1000ul及100ul移液枪、1000ul及100ul枪头、无菌1.5ml的离心管、离心管架3）无菌平皿、涂布棒、接种环实验试剂:无菌水;实验内容1、采土样:选择肥沃土壤,去表层土,挖5－20cm深度的土壤数10g,装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋口,带回实验室。2、制备土壤稀释液：称取土样1.0g，放入盛99ml无菌水的三角瓶中，置摇床振荡20min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。用100ul移液枪从中吸取100ul土壤悬液，注入事先分装有900ul无菌水的离心管中，吹吸3次，振荡均匀（10-3）。然后同样方法，配置成稀释度为10-4，10-5的土壤菌悬液。3、分离1）涂布法用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板（重复）。2）倾注法用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的空白无菌平皿中，然后在各平皿中加入已经融化并冷却到45-50℃的牛肉膏蛋白胨培养基（已灭菌）12-15ml，将培养皿在超净工作台面上轻轻转动，使稀释的菌悬液与融化的培养基混合均匀，直至培养基凝固。注意：无菌操作；用枪头吸取菌悬液时注意“吹打数次”确保混匀。4、培养待平板上液体被完全吸收，将平板倒置于370C温箱中培养24h；5、菌落计数含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可据平板上菌落的数目推算出每克含菌样品中所含的活菌总数（菌落形成数目）。每克含菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU＝（同一稀释度平板上菌落平均数×10×稀释倍数）/含菌样品克数菌落计数规则：选择平均菌落数在30~300间的平板1、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）：1）若0.5≤比值≤2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报告。2）若2≤比值或比值≤0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告。3、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；4、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；所有菌落数均不在30~300间以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数结果与讨论计算含菌样品中的所含活菌总数在恒温箱中培养微生物时为何要倒置？细菌培养基牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15—20g水1000mlpH7.2高氏一号培养基（放线菌分离培养）可溶性淀粉20gKNO31gNaCl0.5g琼脂15—20gK2HPO4·3H2O0.5gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g水1000mlpH7.2~7.4马丁氏培养基（培养真菌）葡萄糖10g蛋白胨5g1/3000孟加拉红水溶液100mlKH2PO41gMgSO4·7H2O0.5g琼脂15—20g水900mlpH自然灭菌后，待培养基融化后冷却至55~60°C时加入链霉素稀释液，使培养基中含链霉素30ug/mL.