快速测定半胱氨酸含量方法的研究

毕业论文2014届快速测定半胱氨酸含量方法的研究学生姓名卓芸芸学号10114339系别化学化工学院专业班级药学102指导教师边可君完成日期2014年5月16日I快速测定半胱氨酸的含量方法研究摘要钙黄绿素是一种具有荧光性的物质，在pH8.0的KH2PO4-NaOH缓冲液中，Cu(Ⅱ)与钙黄绿素配位引起荧光猝灭。由于半胱氨酸与Cu(Ⅱ)的亲和力较强，可从钙黄绿素-Cu(Ⅱ)的络合物中夺取Cu(Ⅱ)而使钙黄绿素游离出来，从而使体系的荧光得以恢复，并且荧光恢复的程度与加入半胱氨酸的量在一定范围内呈线性，从而可以测定半胱氨酸的含量。本实验在钙黄绿素与铜离子1:1，体系时间30min后，激发光谱493nm，发射光谱510nm下进行测定，该法的回归线性方程为：y=22.475x-64.1r为：0.34%回收率为：101.9%。关键词半胱氨酸；钙黄绿素-铜配合物；荧光光度分析方法IIStudyonthemethodofrapiddeterminationofcysteinecontentABSTRACTCalceinisafluorescentsubstance,KH2PO4-NaOHinpH8.0buffer,Cu(Ⅱ)andcalceinligandfluorescencequenching.DuetocysteineandCu(Ⅱ)affinityisverystrong,canfromthecalcein-Cu(Ⅱ)winCucomplex(Ⅱ)andmakethecalceinfreed,Sothatthesystemoffluorescencewasrestored,andthedegreeoffluorescencerestorationandthequantityofaddingcysteineinacertainrangeislinear.Sothatitcandeterminethecontentofcysteine.Thisexperimentinthecalceinwithcopperions1:1,Systemtimeafter30min,Excitationspectrum493nm,Emissionspectrumdeterminationunder510nm,Themethodforthereturnofthelinearequation:y=22.45x-63.6,r:0.34%,Therecoveryrateof:101.9%.KEYWORDScysteine;Calcein-coppercomplexes;FluorescentphotometricanalysismethodIII目录摘要.....................................................................................................................IABSTRACT...........................................................................................................II目录...........................................................................................................................III1绪论.....................................................................................................................11.1常见的测定方法.......................................................................................11.1.1HPLC法测定半胱氨酸的含量.............................................................11.1.2分光光度法测定半胱氨酸的含量.......................................................12实验部分............................................................................................................42.1仪器、药品、试剂..................................................................................42.2实验步骤..................................................................................................42.2.1储备溶液配制.......................................................................................42.2.2体系的激发和发射光谱.......................................................................52.2.3.钙黄绿素及铜离子浓度比对荧光强度的影响....................................52.2.4缓冲溶液pH对荧光强度的影响..........................................................62.2.5反应时间对荧光强度的影响................................................................62.2.6标准曲线的绘制及线性关系考察.......................错误!未定义书签。2.2.7精密度实验...........................................................................................62.2.7回收率实验...........................................................................................62.2.8样品半胱氨酸含量的测定...................................................................73实验结果与讨论................................................................................................73.1磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液的配制.................................................73.2.2缓冲溶液pH对荧光强度的影响.........................................................93.2.3反应时间对荧光强度的影响.............................................................103.2.4半胱氨酸标准曲线...............................................错误!未定义书签。3.2.5钙黄绿素及铜离子浓度比的选择.......................错误!未定义书签。3.2.7回收率的测定.....................................................................................113.2.8样品溶液的测定.................................................................................124结论..................................................................................................................12致谢....................................................................................................................1411绪论半胱氨酸为含硫氨基酸，结构式HSCH2CH(NH2)COOH，半胱氨酸含有巯基(-SH)，胱氨酸含有二硫键(-S-S-)，二者可以相互转变，蛋白质中两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键对维持蛋白质的结构具有重要作用[1]，基于其独特的结构，在动物体内起着营养和免疫相关的重要生理功能。此外，半胱氨酸有刺激前T淋巴细胞分化为成熟的淋巴细胞的作用及增加人体对某些毒素的抵抗力。目前国内外检测半胱氨酸的方法有很多，已报道的测定半胱氨酸的方法有电化学法[2]、流动注射化学发光法[3]、催化动力学分光光度法[4]、旋光度法[5]、高效液相色谱法[6]及荧光分光光度法[7]等。1.1常见的测定方法1.1.1HPLC法测定半胱氨酸的含量高效液相色谱也叫高压液相色谱，是在经典液相色谱法的基础上发展起来的，它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高效性，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故具有分析速度快的优点。王洋等[8]采用高效液相色谱法来测定蛋白质粉中L-半胱氨酸的含量。采用色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18，流动相为0.1％磷酸（pH＝2.05）-乙腈（80∶20），检测波长为210nm，流速为0.6mL·min－1，柱温为室温。结果：L-半胱氨酸检测浓度线性范围为0.02～1.0mg·mL－1（r＝0.9990），平均回收率为98.76％，RSD＝1.82％，检测限为0.01mg·mL－1（S/N≥3）。本方法操作简便，结果准确可靠，重复性好，可用于蛋白质粉中L-半胱氨酸的含量测定。1.1.2分光光度法测定半胱氨酸的含量分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。1.1.2.1以Cu2+为探针-分光光度法测定半胱氨酸的含量[9]2在pH4.0的乙酸盐缓冲溶液中，半胱氨酸中的巯基（—SH）能使Cu2+还原成Cu+，生成的Cu+与SCN-反应生成CuSCN沉淀，所得Cu2+的量为定量生成CuSCN沉淀后留存的过量Cu2+的量，将此Cu2+的测定值间接换算成试样中半胱氨酸的含量。溶液的吸光度和半胱氨酸的质量浓度在在一定范围之间呈线性关系。1.1.2.2以钴离子为探针-分光光度法测定半胱氨酸的含量[10]由于Co2+的高自旋态和有色性，作为生物体系中光谱探针是非常有利的。在NH4Cl-NH4OH缓冲溶液中，Co2+与半胱氨酸能形成稳定的高灵敏度络合物，在紫外区有特征吸收，于284nm、358nm处测其吸光度。实验条件下的半胱氨酸与Co2+的结合比及稳定性与反应时浓度有关，Co2+过量于半胱氨酸或半胱氨酸过量于Co2+生成不同结合比的络合物，其稳定常数也不同，所测得的吸光度也不同。以此建立了测定半胱氨酸分光光度分析方法。方法简便、快速，具有较高灵敏度和较好的选择性。