尖孢镰刀菌

33株尖孢镰刀菌遗传多样性的ISSR分析*张述义1李新凤2韦晓艳2王建明2**（1山西省农业科学院旱地农业研究中心，太原030006；2山西农业大学农学院，山西太谷030801）摘要为明确尖孢镰刀菌种内各菌株间的遗传差异与亲缘关系，采用ISSR分子标记技术对33株地理来源不同的尖孢镰刀菌进行了遗传多样性分析。结果表明，利用筛选出的11条引物扩增出105条条带，其中多态性条带91条，多态性位点比例为86.7%。遗传相似性与聚类分析结果表明，供试菌株间的遗传相似系数为0.606~0.962，平均0.756，当遗传相似系数为0.962时，供试的33株菌可被全部区分开。表明，尖孢镰刀菌基因组在SSR区域具有丰富的多态性。寄主来源相同的供试菌株间的遗传相似性与其地理来源有一定的相关性。关键词尖孢镰刀菌；分子标记技术；ISSR-PCR；遗传多样性中图分类号S43ISSRanalysisofgeneticdiversityof33Fusariumoxysporumstrains.ZHANGShu-yi1，LIXin-feng2，WEIXiao-yan2，WANGJian-ming2(1CenterofDrylandAgriculturalResearch,ShanxiAcademyofAgriculturalScience,Taiyuan030006,China;2ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,Shanxi,China).ChineseJournalofEcology,2013,32(5):1-Abstract:Toclarifythegeneticdifferenceandphylogenyrelationshipamongintraspecificstrains,thegeneticdiversityof33Fusariumoxysporumstrainsfromdifferentareaswereexaminedbyinter-simplesequencerepeats(ISSR).Theresultsindicatedthatatotalof105bandswereamplifiedwith11selectedISSRprimers,91(86.7%)ofwhichwerepolymorphic.TheclusteranalysisbasedontheISSRdatashowedthatthegeneticsimilarityrangedfrom0.606to0.962,withtheaverageof0.756.Allthestrainstestedcouldbedistinguishedat0.962.ThisindicatedthattheSSRlociinFusariumoxysporumgenomeswererichinpolymorphism.Therewassomecorrelationbetweengeneticsimilarityandgeographicoriginofstrainsisolatedfromthesamehost.Keywords:Fusariumoxysporumstrains;molecularmarker;ISSR-PCR;geneticdiversity.尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）是镰刀菌属（Fusarium）真菌中一个重要的种，可侵染多种植物引起维管束萎蔫病害，对农业生产造成严重威胁（陈鸿逵和王拱辰,1992）。由于该菌具有易变异与多型性的特点，种内生理分化十分明显，在种下又可分为多个专化型和生理小种，因此镰刀菌的遗传多样性一直都是该菌的研究热点（O’Donnell,1996）。多年来，人们都是依据形态学特征、致病性及营养体融合群试验等来研究该菌的多态性，而这些方法既费时费力又不能准确地揭示物种的进化关系。随着分子生物学的发展，分子标记技术已被广泛应用于真菌类群的多样性分析，国内外研究表明，运用分子生物学相关技术分析镰刀菌遗传多态性能从DNA水平上反映菌株间的本质差异(Yli-Mattilaetal.,2002；Konstantinova&Yli-Mattila,2004；Visentinetal.,2009）。目前，应用于镰刀菌遗传多样性分析的分子标记技术主要有RFLP、AFLP、RAPD、rDNA-ITS、ISSR等，ISSR简单序列重复区间标记技术与其他技术相比，具有重复性好、多态性丰富、费用低、操作简便等优点，已被广泛地应用于各物种的遗传多样性及相关领域的研究（甘琴华等,2008；谷守芹等,2008；毛岚等,2009；李挺丹等,2010；赵云福等,2010）。研究表明，*山西省科技攻关项目（20100311019-2）、山西省自然科学基金(2006011080)和山西省科技攻关项目(20120311019-3)资助。**通讯作者E-mail:[e-mail]收稿日期：2012-09-23接受日期:2013-01-14该技术在分析镰刀菌的遗传多态性方面，特别是种内遗传多样性上有其独特的优势（Mishraetal.,2003；Mishraetal.,2004；李蕊倩等,2009；Dinolfoetal.,2010）。目前，尖孢镰刀菌遗传多样性的研究多集中于个别专化型内各菌株的研究（Hawareetal.,1995；Balmasetal.,2005；段会军等,2008；Bayraktaretal.,2008；Dubey&Singh,2008；Baysaletal.,2010；苑琳等,2012），有关种内不同寄主和地理来源的菌株间的ISSR遗传多样性分析未见报道，因此在传统分类基础上，应用ISSR分子标记技术研究尖孢镰刀菌种内的遗传差异与系统发育，建立各进化类群与形态学特征的关系，对尖孢镰刀菌的分类鉴定、尖孢镰刀菌萎蔫病害的防治和相关领域的研究具有重要的理论和实际意义。本研究以采自山西省不同地区不同寄主的33株尖孢镰孢菌与河北的2株尖孢镰孢菌为研究对象，采用ISSR-PCR技术对其进行遗传多样性研究，并探讨其遗传多样性与寄主和地理分布的关系，旨在为今后深入开展尖孢镰刀菌的遗传分化和系统发育等研究提供科学依据。1材料与方法1.1材料供试菌株：供试菌株为分离自不同寄主作物上的尖孢镰刀菌单孢分离物，其寄主及采集地如表1所示。结合Booth分类系统与Leslie分类方法对供试菌株进行形态学鉴定（BoothBooth,1988；Leslie&Summerell,2006）。供试引物：13个ISSR引物自加拿大英属哥伦比亚大学（UniversityofBritishColumbia）公布的序列中选出（周延青,2005），由北京赛百盛生物技术有限公司合成。试验仪器：PCR基因扩增仪（MJReasearchUSA）、凝胶成像分析系统（Sigma公司）、DYY-11型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）等。试验试剂：RNaseA、DNAmaker、TaqDNAPolymerase、dNTP购于北京天根生物技术有限公司。表1供试菌株及来源Table1Testedisolatesandtheirlocationsinthestudy编号寄主菌株采集地1绿豆Vignaradiata尖孢镰刀菌山西祁县2蚕豆Peronosporaviciae尖孢镰刀菌山西太谷3地豆Phaseolusvulgaris尖孢镰刀菌山西太谷4黄瓜Cucumissativus尖孢镰刀菌山西夏县5黄瓜尖孢镰刀菌山西夏县6黄瓜尖孢镰刀菌山西太谷7黄瓜尖孢镰刀菌山西太原8黄瓜尖孢镰刀菌山西太谷9西瓜Citrulluslanatus尖孢镰刀菌山西夏县10黄瓜尖孢镰刀菌山西太原11西瓜尖孢镰刀菌山西祁县12西瓜尖孢镰刀菌山西太谷13西葫芦Cucurbitapepo尖孢镰刀菌山西太谷14番茄Lycopersiconesculentum尖孢镰刀菌山西太谷1番茄尖孢镰山西5刀菌大同16辣椒Capsicumannuum尖孢镰刀菌山西太谷17茄子Solanummelongena尖孢镰刀菌山西祁县18茄子尖孢镰刀菌山西五寨19茄子尖孢镰刀菌山西太谷20茄子尖孢镰刀菌山西阳城21棉花Gossypiumsp.尖孢镰刀菌山西运城22棉花尖孢镰刀菌山西襄汾23棉花尖孢镰刀菌山西太谷24胡麻Linumusitatissimum尖孢镰刀菌山西大同25芝麻Sesamumindicum尖孢镰刀菌山西襄汾26芝麻尖孢镰刀菌山西祁县27兰花Micheliachapensis尖孢镰刀菌河北保定28兰花尖孢镰刀菌河北保定29兰花尖孢镰刀菌山西长治30茄子尖孢镰刀菌山西神池31西瓜尖孢镰刀菌山西太谷32番茄尖孢镰刀菌山西太谷33西瓜尖孢镰刀菌山西祁县1.2研究方法1.2.1菌体培养与模板DNA的制备菌体培养：将供试尖孢镰刀菌菌种经PDA平板活化后，接种到查彼培养液中，25℃恒温振荡培养5d，然后抽滤菌丝，将其烘干。模板DNA的制备：采用改进的SDS-CTAB法抽提镰刀菌基因组DNA（Lodhietal.,1994），所提取的DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳后，在GIS凝胶成像分析系统中拍照，分析荧光强度，以标准DNA分子量作对照，并用紫外吸收法检测DNA浓度，然后将DNA浓度稀释成20ng·μL-1，贮存于-20℃冰箱中备用。1.2.2ISSR扩增反应ISSR扩增反应体系（李蕊倩等,2009）：PCR反应体系为20μL，其中包含1.0UTaqDNA聚合酶、1.5mmol·L-1MgCl2、0.15mmol·L-14×dNTP、0.5μmol·L-1引物、20ng模板DNA。PCR扩增反应程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸7min。1.2.3ISSR引物筛选与PCR产物检测随机选取3个供试菌株的基因组DNA为模板，利用合成的ISSR引物对其进行扩增，然后比较扩增结果，从中选择多态性和重复性好的引物对33株供试菌株的基因组进行PCR扩增，反应结束后，用1.5%的琼脂糖凝胶（含0.5mg·L-1核酸染色剂）将扩增产物进行分离，并用GIS凝胶成像分析系统对电泳分离结果观察拍照。1.2.4电泳谱带的记录及数据统计分析电泳图谱中每条扩增带均代表了引物与模板DNA互补的1个结合位点，可记为1个分子标记。将PCR扩增的DNA条带转换成二进制数据，记录每条引物对每个菌株的扩增结果，电泳图谱中相同迁移位置上有扩增带的记为1，无带的记为0。利用NTSYSpc（Version2.11e）软件计算供试各菌株间的遗传相似系数，并进行聚类（UPGMA）分析与主成分分析（PCA）。2结果与分析2.1ISSR引物筛选与PCR扩增结果根据引物筛选的扩增结果，从13条引物中筛选出11条扩增条带清晰、多态性明显、重复性好的引物，对33株供试尖孢镰刀菌菌株进行了ISSR-PCR扩增。结果表明（表2），当退火温度为52℃或54℃时，这些引物都具有良好的扩增多态性，共扩增出105条条带，不同引物扩增条带数不同，多数为8~12条。其中，807、831、891号引物扩增出的条带数最多，为12条；引物809扩增出的条带数最少，为4条，这些条带多分布在400~2000bp（图1），其中特征性条带（多态性位点）为91条，多态性位点比例为86.7%，平均每个引物产生多态性条带8.3条。表211条ISSR引物对33株尖孢镰刀菌的扩增结果Table2Amplificationresultsof33Fusariumoxysporumstrainswith11ISSRprimers引物序列退火温度(℃)扩增条带多态性条带多态性比例(%)807（AG）8T54121191.7808（AG）8C549666.7809（AG）8G5444100812（GA）8A528562.5831（AC）8YA52121191.7835（AG）8YC5288100882VBV（AT）754--