尿中多环芳烃测定

尿中多环芳烃（PAH)四种羟基代谢物------高效液相色谱法(HPLC)杨玲刘丹丹康静多环芳烃简介多环芳烃(PAHs)是人类最早发现的一类环境有机致癌化合物。PAHs广泛存在于空气颗粒物和烟熏烧烤类食品中。另外,香烟烟雾中也含有高浓度的PAHs。PAHs种类繁多、在环境中分布广,主要通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体,经体内代谢转化后,生成DNA加合物。PAHs与人们的生活息息相关，在致癌类化合物中占有相当重要的地位。检测指标那么如何评估人体内外PAHs的暴露量呢？目前使用较多的是生物标志物法，即通过测人体组织或体液中的PAHs或其代谢产物综合反映人体对PAHs的暴露情况。许多生物标记物，包括PAH-DNA、PAH-蛋白质、PAH尿代谢物等，都被用于衡量人体PAHs暴露量。PAH进入人体后，经代谢形成多种代谢产物。可通过测定尿中四中代谢产物来反应内暴露情况。2-羟基萘2-羟基芴9-羟基菲1-羟基芘1—羟基芘是常用的生物标志物，它是芘的主要代谢物，在尿样中通常以葡萄糖醛酸酯和芳基硫酸酯的形式存在。用HPLC来进行四种物质的定量测定，需在上机前对样品进行严格的处理。上机前尿样处理步骤：取尿样6ml于15ml离心管离心2000rpm/min10min取上清5ml,调PH5.00—5.09后，加醋酸盐缓冲液和β-葡萄糖醛酸酶37℃水浴摇床，14h离心后，进行固相萃取固相萃取用的装置固相萃取用碳18柱碳18颗粒第一步：活化（5ml纯甲醇）第二步：平衡（5ml超纯水）注意：每一步操作要在上一步液体到达上筛板之前加入！调节滴速每秒3-4滴上样第一步：吸附（5ml尿样）第二步：清洗（10ml超纯水）（10ml30%甲醇）洗脱加两次3ml纯甲醇记录每个试管液面高度（6ml左右）氮吹用氮气将试管吹干（6小时左右）用70%甲醇1ml溶解后倒入1.5mlEP管中，上机前先离心，取200ul于棕色瓶。上机高效液相色谱法色谱法的原理：利用混合物在流动相（甲醇）和固定相（碳18）中分配系数不同，使固定相（碳18）对各组分（1—羟基芘、9—羟基菲、2—羟基芴、2—羟基萘）的保留作用不同，产生差速迁移，使各组分得到分离。流动相在开机前需进行脱气处理。差速迁移：在色谱分离过程中，当流动相携带试样对固定相作相对运动时，由于试样中各组分在固定相和流动相之间的作用力（如吸附力、溶解力、离子交换力、分子排阻力和亲和力等）有微小差别，使得不同组分被流动相运载移动的速率不同，产生差速迁移，致使性质有微小差异的不同组分被分离。组分分配在固定相中的浓度组分分配在流动相中的浓度K=K值大小与组分的保留时间有关，即与峰形出现的时间有关分配系数：在一定温度和压力条件下，组分在固定相和流动相之间的分配达到平衡时，组分分配在固定相与其分配在流动相中的平均浓度之比。高效液相色谱法是利用高压输液泵驱使流动相（甲醇）通过装填固定相（碳18）的色谱柱，按照固液相之间的分配机制对混合物进行分离的方法。液固吸附色谱法在吸附色谱中，组分分子和流动相分子对吸附剂（固定相）表面产生竞争性吸附，利用组分和固定相吸附力的不同而分离。高压输液系统进样系统分离系统检测系统贮液瓶高压输液泵梯度洗脱装置色谱柱高效液相色谱仪的工作流程：高压泵将贮液器中经过过滤和脱气的流动相经由进样器送入色谱柱，然后从检测器流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器的流动相将样品带入色谱柱中进行分离。分离后的各组分依先后顺序进入检测器，检测器将个组分浓度信号转变为易于测量的电信号，经色谱工作站处理得到色谱图。梯度洗脱装置（溶剂程序）在分离过程中，流动相的组成随时间改变而改变，按一定程序不断改变流动相（甲醇）的配比，使溶剂极性、离子强度或pH值改变，使被测组分的相对保留值得以改变，从而改进复杂样品的分离，改善峰形、缩短分析时间，提高分离效率。本实验选择荧光检测器，因为其对温度和流动相流速的变化不敏感，可以进行梯度洗脱。溶剂的梯度洗脱程序荧光检测器波长的选择2---羟基萘Ex：227nmEm：335nm2—羟基芴Ex：275nmEm：330nm9---羟基菲Ex：255nmEm：385nm1—羟基芘Ex：242nmEm：396nm柱温色谱图：是电信号对时间的曲线，又称色谱流出曲线。色谱峰：色谱图中最突出的部分。正常的色谱峰，是对称正态分布的曲线。基线：仅有流动相通过检测器时，仪器记录的响应信号曲线。横坐标：保留时间(T)，组分从进样到出现信号最大值的时间。纵坐标：响应信号（LU)。重要参数定性参数：保留值（保留时间t）定量参数：峰面积s：峰与峰底之间的面积。峰高h：色谱峰最高点至峰底之间的距离。缝宽w：色谱峰两侧拐点处的切线在基线上截取的距离。色谱峰的甄选：