学习情境九微生物的分离纯化与保藏技术

学习情境九微生物的分离、纯化与保藏技术任务一微生物分离、纯化技术任务二微生物菌种保藏技术任务一微生物的分离、纯化技术了解纯种分离技术的原理掌握无菌操作和纯种分离技术微生物纯化、分离的原因自然界中，微生物都是以群居的方式存在的在人为条件下培养的微生物群体称为培养物(culture)只有一种微生物的培养物称作纯培养物(pureculture)纯培养的过程通过分离、纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物接种技术无菌操作技术一、接种技术接种工具接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀无菌技术(aseptictechnique)在分离、转接及培养纯培养物时，防止其被其它微生物污染的技术纯培养物环境二、微生物分离纯化技术分离(isolation)：从混杂微生物群体中获得只含有某一种微生物的过程称为微生物分离与纯化。用固体培养基分离用液体培养基分离单细胞分离富集分离1.利用固体培养基分离原理：微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养1.利用固体培养基分离值得指出的是：在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到视频录像（1）稀释倾注平板法（pourplatemethod）•先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1∶10、1∶100、1∶1000…）•然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落•如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的•随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养倾注平板（2）涂布平板法（spreadplatemethod）将含菌的样品加入还比较烫的琼脂培养基，再倒平板，易造成某些热敏感菌的死亡某些好氧菌会在琼脂中间缺氧影响生长涂布vs.倾注(3)平板划线分离法（streakplatemethod）(3)平板划线分离法（streakplatemethod）连续稀释的过程平板划线分离的方法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法2.用液体培养基分离纯培养稀释法原理：连续稀释，使一只试管里分配不到一个微生物如果大多数平行稀释管里没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物就是纯培养物3.单细胞挑取分离法4.富集分离法利用选择培养基创造只让所需微生物生长的条件，所需微生物有效地与其他微生物竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如分离专性寄生菌，须把样品接种到相应敏感宿主细胞群中，使其大量生长。多次重复移种便可得到纯的寄生菌。附：一些操作技术图片培养倒平板isolationplate•移接斜面常用的接种方法划线接种点接种穿刺接种涂布接种液体接种注射接种斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞•纯化（平板划线法）倒平板——划线——培养——挑菌落——纯种（纯培养）任务二微生物菌种保藏技术一、菌种的衰退与复壮的1.衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变生长速度缓慢，产孢子越来越少抵抗力、抗不良环境能力减弱等代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降2、菌种的复壮：使衰退的菌种恢复原来优良性状菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）；通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillusthuringiensis的复壮）；淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）；采用有效的菌种保藏方法。3、防止菌种衰退的方法：控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8～10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）；选择合适的培养条件；采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；采用有效的菌种保藏方法。二、菌种保藏1、目的：存活，不丢失，不污染；防止优良性状丧失；随时为生产、科研提供优良菌种。2.原理选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等）创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制难以发生突变的环境条件（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养等）添加保护剂3.菌种保藏的方法菌连续在培养基上（内）移种种生活态传代培养保藏法连续在活宿主上（内）移种保固体斜面藏湿法半固体琼脂柱方休眠态液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管内吸附在合适的载体上方法：①低温保藏法：方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代。原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。②石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。③干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。④真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。⑤液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196℃）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。干法保藏菌种的方法滴入小试管（在放入大试管干燥器中）藏在玻璃管内封入安培瓶菌液直接真空干燥法（L-干燥法）冷冻真空干燥法细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒）球块状载体（硅胶、瓷球）合适的载体有机基质（曲料、麦粒）滤纸片薄片状载体明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成）血清蛋白小片（…乙烯薄膜…）几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类**产孢子微生物各大类3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上简便简便简便简便有效简便有效