实时荧光定量PCR20160520

实时荧光定量PCR（Real-timePCR）技术简介刘亭2016.05.25内容•Real-timePCR原理•Real-timePCR用途•Real-timePCR实验PCR原理常规PCR：扩增DNA，借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析变性退火延伸Y0×2×4×8×16……Y0×2n实时荧光定量PCR:扩增DNA，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析Real-timePCR原理Y0×2×4×8×16……Y0×2n扩增曲线背景期对数增长期线性增长期平台期–荧光嵌合法（非特异性）SYBRGreenI–荧光探针法（特异性）TaqManprobeCyclingprobe……RealTimePCR的荧光化学检测原理非特异性的荧光嵌合法——SYBRGreenI•SYBRGreenI是一种能够结合于所有双链DNA小沟中的荧光染料，SYBR与PCR合成DNA双链结合后，发射荧光信号，而游离的SYBR不会发射荧光信号，因此荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步•优点：简单易行，成本较低•缺点：与非特异性产物结合，不能进行多重PCR•适用：不同样本同一基因相对表达量分析特异性荧光探针法——TaqManprobe•Taqman探针是一段与目的基因配对的DNA序列，5‘端加荧光物质，3‘端加淬灭物质，完整探针5‘端的荧光物质被3‘端淬灭物质抑制，不发荧光，当PCR合成DNA，退火时探针和DNA配对，延伸时，由于DNA聚合酶也有核酸外切酶活性，将探针分解，5‘端荧光物质游离出来，发出荧光，检测荧光强度，表征PCR扩增的DNA量。•优点：特异性强，能进行多重PCR•缺点：需设计特异性探针，成本较高•适用：区别同源性高的序列，SNP解析等多重PCR检测•重要术语:•阈值（Threshold）：在扩增曲线指数增长期设定的荧光检出界限（第3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍）•C(t)值（Cycleofthreshold）：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数阈值C(t)值18.12+/-0.0418.12+/-0.0418.12+/-0.04C(t)值18.12+/-0.04RealTimePCR的数学定量原理•绝对定量•相对定量RealTimePCR的数学定量原理•初始DNA量越多，越早达到阈值，扩增曲线越早起峰，Ct值越小•经数学理论证明，初始DNA量的对数值与循环数/Ct呈反比线性关系肿瘤正常绝对定量•将已知浓度的标准品进行梯度稀释，进行RealTimePCR,会得到一系列等间隔的扩增曲线。以它们的Ct值作横坐标，初始DNA量的对数值为纵坐标，作图得到标准曲线，未知浓度的样品进行RealTimePCR,得到Ct值，代入标准曲线，可以样品的初始DNA量。10410310610510210荧光强度---循环数曲线初始DNA量对数---Ct循环数标准曲线•绝对定量通过标准曲线确定初始DNA/RNA基因拷贝数或浓度，通常用于病毒，病原菌的定量检测即转基因食品食品的检测。相对定量•比较不同样本之间基因表达量的高低变化，需要做相对定量。•相对定量引入内参基因，即维持细胞基本代谢活动所必需的基因，其表达量在不同的细胞里基本一样，在扩增目的基因的同时扩增内参基因，用不同样本的目的基因的扩增量与各自内参基因的扩增量的比值对目的基因表达量进行均一化后，再比较高低，可以对不同样本间细胞起始数，RNA提取效率，基因扩增效率的不同进行矫正。Real-timePCR用途•定性分析:•病毒和病原菌检测;•单核苷酸多态性（SNP）检测;•物种鉴定•定量分析:•绝对定量:•病毒和病原菌定量;•基因拷贝数分析;•转基因定量分析•相对定量:•基因表达量分析基因表达的中心法则Real-timePCR实验——以癌细胞药物处理后不同时间点某基因表达量的变化为例•SYBRgreen1的相对定量法：•一、实验设计，材料处理，取材冻存•二、目的和内参基因的选择及引物设计•三、准备试剂与耗材，预约仪器•四、RNA提取，质量与浓度检测，反转录成cDNA•五、按反应体系准备样品•六、上机设定反应条件，运行程序进行反应•七、溶解曲线分析荧光信号产生的特异性•八、获得数据，计算分析结果并做图对照组Control处理组Drug112h重复1重复2重复30h3h6h12h重复1重复2重复33h6h一实验设计，材料处理，取材冻存（-80℃）菌检健康的癌细胞对照组处理组0h#1#2#33h#4#5#6#7#8#96h#10#11#12#13#14#1512h#16#17#18#19#20#21二目的和内参基因的选择及引物设计•目的基因的选择：根据实验目的•内参基因的选择：•维持细胞基本代谢活动所必需的基因，如GAPDH，Actin，18SrRNA等•通过查文献或实验筛选•引物设计注意事项：引物设计软件Oligo7三、准备试剂，耗材，预约仪器•试剂：RNA提取试剂盒，cDNA反转录试剂盒（≥21次反应），SYBRmix（≥21×2次反应）等•耗材：枪头，EP管等（无RNase处理），96/384孔版，透明薄膜，冰及冰盒等•仪器：枪，离心机，Nanodrop核酸浓度测定仪，核酸电泳仪，荧光定量PCR仪等四、RNA提取，质量与浓度检测，反转录成cDNA•针对样品选用一款合适的RNA提取试剂盒•取相同量的组织或细胞提取总RNA•提取的总RNA常混有基因组DNA，可以通过DNase处理去除或跨内含子引物设计避免基因组DNA扩增•RNA电泳检测降解情况•Nanodrop测定RNA浓度和纯度（OD260/280≥2，OD260/230≥2）•取相同量的RNA（如1ug）做反转录•RNA易降解，而cDNA可于-20℃保存很久五、按反应体系准备样品•上述cDNA需要进行稀释，稀释倍数实验摸索（使内参Ct约20）•每个样品做2个技术重复，事先设计好样品在96孔板上的排列•先把稀释好的cDNA加到96孔板，再加混好的SYBRmixture,primer,H2O加入96孔板，盖上透明薄膜，离心后上机•反应体系：内参×42目的×42TemplatecDNA4uL2×SYBRmixture10uL420uL420uLForwardprimer0.5uL21uL21uLReverseprimer0.5uL21uL21uLH205uL220uL220uLTotal20uL内参目的112233445566778899101011111212131314141515161617171818191920202121112233445566778899101011111212131314141515161617171818191920202121六、上机设定反应条件，运行程序进行反应•参考SYBRgreen1Kit的说明书•预变性：95℃,30s,20℃/s•——1cycle•PCR反应：95℃,5s,20℃/s•60℃,20s,20℃/s•——40Cycles•溶解曲线分析：95℃,0s,20℃/s•72℃,15s,20℃/s•95℃,0s,0.3℃/s七、从溶解曲线确认PCR反应的特异性溶解曲线的一次曲线溶解曲线的负一次曲线微分曲线•PCR反应结束后，扩增产物呈双链，具有较高的荧光信号强度，此时，将PCR反应液的温度渐渐升高，DNA双链渐渐打开，嵌入DNA双链中的SYBRGreen数量减少，荧光信号强度渐渐降低，当双链DNA解链一半时，荧光信号强度急剧下降，此时的温度即溶解温度（Tm值），对于某一特定的PCR扩增产物，其值是固定的。八、获得数据，计算分析结果并做图样品内参Ct目的Ct相对表达量120.15120.12220.13220.14319.88319.99420.45420.21519.45519.70………………Power(内参Ct-目的Ct，2)谢谢关注，欢迎交流讨论！聚合酶链式反应PCR原理常规PCR：扩增DNA，借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析常规PK实时PCR实时荧光定量PCR常规PCR能进行定量或定性分析灵敏度高，精确度高不需要电泳分析，省时，安全，不易污染需要荧光定量PCR仪，荧光染料等，成本较高只能进行半定量或定性分析灵敏度低，精确度低需要电泳分析，费时，不安全，易污染只需要普通PCR仪与PCR试剂，成本较低各种荧光检测方法比较SYBRgreentaqmanCycling优点缺点适用范围RealTimePCR定量的数学原理理想的PCR反应：Yn=Y0×2n非理想的PCR反应：Yn=Y0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:logYn=log［Y0(1+Ex)n］整理方程式得:logY0=［-log(1+Ex)］×n+logYn将Ct和YCt带入上式得：logY0=［-log(1+Ex)］×Ct+logYCtn：扩增反应的循环次数Yn：第n次循环后的产物量Y0：初始DNA量Ex：扩增效率初始DNA量的对数值与循环数/Ct呈反比线性关系Real-timePCR用途定性分析定量分析绝对定量相对定量病毒和病原菌检测单核苷酸多态性/SNP检测物种鉴定病毒和病原菌定量基因拷贝数分析转基因定量分析mRNA表达量分析Cyclingprobe利用Cycleave法的SNP解析原理利用Cycleave法的SNP解析原理对照组Control处理组Drug112h重复1重复2重复30h3h6h12h重复1重复2重复33h6h0h-1,0h-2,0h-3(1-3)C-3h-1,C-3h-2,C-3h-3(4-6)C-6h-1,C-6h-2,C-6h-3(7-9)C-12h-1,C-12h-2,C-12h-3(10-12)D-3h-1,D-3h-2,D-3h-3(13-15)D-6h-1,D-6h-2,D-6h-3(15-18)D-12h-1,D-12h-2,D-12h-3(19-21)一实验设计，材料处理，取材冻存（-80℃）菌检健康的癌细胞标准曲线相对定量法•用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线•处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值•用内标基因对目标基因均一化•处理样本与未处理样本目标基因C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异2-ΔΔc(t)法•公式推导–M:目标基因，N：内标基因–XC(t)M=X0M*2C(t)M=A(域值)(1)–XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值)(2)–均一化(1)/(2):–X0M/X0N=2C(t)N-C(t)M=2-ΔC(t)–处理2与处理1相比：–(X0M2/X0N2):(X0M/X0N)=2-ΔC(t)2-ΔC(t)1=2-ΔΔC(t)–ΔΔC(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1)•当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比