实验2氨基酸分离双向层析法

实验2氨基酸分离——双向层析法目的要求（1）学习双向纸层析的原理；（2）掌握纸层析法分离混合氨基酸的操作方法。实验原理纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。Rf=原点至溶剂前沿的距离点的距离原点至纸层析斑点中心纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。由于滤纸纤维可吸收20～25%的水分；且其中6～7%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。层析溶剂要求：（1）被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.05～0.8之间，各组分之Rf值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。（2）溶剂系统中任一组分与被分离物之间不能起化学反应。（3）被分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱，如图1所示。图1八种混合氨基酸双向层析图谱试剂和器材一、试剂0.1%（W/V）茚三酮丙酮溶液。溶剂系统：第一相：正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2（V/V）；第二相：正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1（V/V）。二、测试样品标准氨基酸混合溶液：leu、val、phe、pro、ala、asp、his、ser各100mg溶于50mL0.01mol/L盐酸中；八种单个氨基酸溶液。三、器材层析缸25×40cm（×2）；培养皿9cm（×2）；喉头喷雾器；毛细管内径0.1cm；电吹风；烘箱。层析滤纸12×12cm；铅笔，尺。操作方法一、点样取层析滤纸一张（12×12cm），在距纸边1.2cm处划一基线；再将纸转90°，距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交点处（见图2），点的直径控制在2mm左右，不可过大。待样品干燥后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连，但不可重叠相碰。二、展层在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入，点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约1小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸，悬挂于室温中，用电吹风充分吹尽溶剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转90°，卷成如前圆筒状，放入盛第二相溶剂的层析缸内展开（操作同上，图3.3），约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm时取出，用电吹风吹尽溶剂使其干燥。三、显色用喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于65℃烘箱内，烘20分钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。用直尺量出各斑点中心与原点的距离以及溶剂前沿与原点的距离，求出各氨基酸的Rf值。将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的准确成分。注意事项（1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。（2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化，影响层析效果。（3）整个实验操作应戴手套进行。（4）展层剂均为有机溶剂挥发性强、味道重，因此实验结束后回收至废液瓶中。思考题1．酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？2．为什么展层时要用两种溶剂系统？图2纸层析点样、展层示意图（X,Y分别为原点至斑点中心和溶剂前沿的距离，x为点样原点）