实验3细胞固定剂及透膜剂对细胞膜透性的影响

细胞生物学实验实验32015/4/6实验3细胞固定剂及透膜剂对细胞膜透性的影响姓名：李思露学号：131140040一、实验目的1．通过观察红细胞在不同液体中的表现，加深对细胞膜选择通透理论的理解2．探索细胞固定剂及透膜剂对细胞膜通透性的影响二、实验原理1.红细胞膜为选择性通透性膜，容许某些分子进出细胞，若进入细胞的液体多于出细胞的液体，就会造成红细胞胀大；当细胞体积增加超过67％时，红细胞膜破裂、溶血（胀破，血红蛋白释放到介质中）；而当出细胞的液体多于进入细胞的液体时，红细胞出现皱缩现象。2.细胞透膜剂TritonX-100可破坏细胞膜脂质双层而引起正常细胞破坏。3.化学固定剂能够使细胞内大分子交联或沉淀，继而由流动状态变为固定状态。4.固定前后的细胞在低渗液及透膜剂中的变化不同，可通过溶血实验及选择性透膜染料染色加以显示。5.细胞膜对不同物质的通透性（１）带电离子不能直接通过脂双层膜（２）小的极性分子，如水、尿素、CO2等，能穿过脂类分子的极性头部区而得以穿过脂双层，穿膜速度取决于油／水分配系数及溶质（水）产生的渗透压。（３）不带电荷的有机小分子，如一些小分子醇类，可以通过简单扩散（靠浓度差）直接穿过脂质双层进出细胞。三、实验材料、试剂及器材1.材料：绵羊抗凝全血2.试剂（１）0.01mol/L(pH7.2)PBS（２）10%中性福尔马林固定液（３）0.4%台盼蓝生理盐水染液（４）蒸馏水（５）0.5mol/L氯化钠（６）0.2%TritonX-100生理盐水３.器材（１）10mL低速离心机、普通光学显微镜（２）10mL刻度试管、试管架、胶头吸管、载玻片及盖玻片等细胞生物学实验实验32015/4/6四、实验操作１．制备50%绵羊血细胞悬液。血细胞样品的准备：取１支１０ｍＬ的刻度离心管，加入５ｍＬ血液，１０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，弃上清；再向细胞沉淀加５ｍＬ０．９％生理盐水重悬细胞，１０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，弃上清；视细胞沉淀体积，加等体积生理盐水重悬细胞，使成５０％的细胞悬液。２．细胞固定。（1）取１支10mL刻度离心管，向1支加入0.5mL50%绵羊血细胞悬液（2）1000r/min离心5min弃上清；（3）加入2mL10%中性福尔马林固定液，固定20min；（4）1000r/min离心5min弃上清；（5）用氯化钠生理盐水恢复至原来体积。３.固定前后红细胞变化的检测（1）固定前红细胞在不同渗透性溶液及TritonX-100中的变化检测1.5mL0.15mol/L氯化钠溶液+1滴血1.5mL0.5mol/L氯化钠溶液+1滴血1.5mL蒸馏水+1滴血1.5mL0.2%TritonX-100的生理盐水溶液1滴血（2）固定后红细胞在低渗液及TritonX-100中的变化检测1.5mL蒸馏水+1滴血1.5mLTritonX-100溶液+1滴血。４.检测不同醇溶液对细胞的影响。五、实验现象及结论１.固定前红细胞在不同渗透性溶液及TritonX-100中的变化检测序号溶液类型实验现象实验现象（１）0.15mol/L氯化钠溶液试管中血液浑浊，无溶血现象发生，显微镜下细胞形态未发生变化，仍是双面凹的圆饼状（２）0.5mol/L氯化钠溶液试管中血液浑浊，无溶血现象发生，显微镜下有一些细胞发生皱缩。（３）蒸馏水加入血液后立刻溶血（1s之内），试管由浑浊变得澄清透明，显微镜下看不到完整的细胞。细胞生物学实验实验32015/4/6（４）0.2%TritonX-100的生理盐水溶液加入血液后立刻溶血（1s之内），试管由浑浊变得澄清透明，制作装片时，滴到载玻片上的混合液会迅速扩散至整个玻片，显微镜下看不到完整的细胞。同上（1）红细胞悬液无溶血现象，红细胞形态不发生变。原因是0.15mol/L的氯化钠溶液与红细胞等渗。（2）红细胞悬液无溶血现象，红细胞边缘出现毛刺，说明红细胞膜发生了皱缩。原因是0.5mol/L的氯化钠溶液的渗透压高于红细胞的渗透压，红细胞失水皱缩。（3）红细胞悬液出现溶血现象，视野中无完整的红细胞，只有一些破碎的细胞膜。原因是蒸馏水的渗透压低于红细胞的渗透压，红细胞吸水胀破。（4）红细胞悬液出现溶血现象，视野中无完整的红细胞，只有一些破碎的细胞膜。原因是细胞透膜剂TritonX-100可破坏细胞膜脂质双层而引起正常细胞破坏，大量溶液进入红细胞内使其破碎。２.固定后红细胞在低渗液及TritonX-100中的变化检测序号溶液类型实验现象（１）蒸馏水起初不发生溶血现象，试管内血液浑浊，放置６分３０秒后，试管内血液变得完全澄清透明。（２）0.2%TritonX-100的生理盐水溶液起初不发生溶血现象，试管内血液浑浊，放置4分钟后，试管内血液变得完全澄清透明。（1）红细胞悬液最终发生溶血现象，红细胞破裂。原因是固定剂使细胞的蛋白质凝固，防止细胞自溶或异溶，以保持原有结构和形态，所以更难发生溶血现象。（2）蒸馏水所用时间比TritonX-100的生理盐水溶液要短，这是由于TritonX-100的生理盐水溶液可以破坏已经被固定的红细胞的细胞膜，加速溶血现象的发生。３．固定前红细胞在０.８Ｍ醇溶液中的变化检测序号溶液类型实验现象（１）正丁醇起初稍有浑浊，１１ｓ后完全澄清。（２）乙醇起初比正丁醇更浑浊，比正丁醇溶血的时间要长，约为１３ｓ。（３）乙二醇起初十分浑浊，溶血过程中可以观察到有破碎的红细胞颗粒，溶血时间更长，约为３４ｓ。（1）对比正丁醇和乙醇的溶血时间，可知在相同浓度的不同醇溶液中，发生溶血的时间长短不同。理论上应该是乙醇的溶血时间要低于正丁醇的溶血时间，这是由于碳链短、分子量小的分子更容易进入细胞，细胞内渗透压升高更快,细胞更容易吸水胀破，但是本组的实验结果并不符合这一结论，推测是由于两者溶血时间比较接近，计时存在误差使得乙醇的时间长于正丁醇。（2）对比乙二醇和乙醇的溶血时间，可知在相同浓度的不同醇溶液中，发生溶血的时间长短不同。乙醇的溶血时间低于正丁醇的溶血时间，这是由于羟基少的分子极性弱，更容易透过细胞膜，细胞内渗透压升高更快,细胞更容易吸水胀破。３.发生溶血的细胞悬液与未发生溶血的细胞悬液。细胞生物学实验实验32015/4/6六、作业与思考题描述各种处理引起的红细胞悬液及红细胞的变化并解释原因。答：见五、实验现象及结论七、反思与改进１.判断细胞时候溶血的标准要统一，以免造成误差，得出与理论不符的结论。２.固定细胞时用氯化钠溶液恢复至原体积是指恢复至加入福尔马林之后的体积而不是最初的体积，若恢复至初体积是的固定后的细胞悬液过稀，影响后续实验。附：原始记录溶血非溶血