实验3藻类培养201411110

实验3淡水藻类植物的采集和培养一、实验目的1藻类植物的分布很广，种类也很多，学生通过对淡水生藻类植物进行调查、采集和培养，可以增加学生藻类植物工作的经验，培养学生参加科研工作的积极性，提高学生科研工作的能力。2学生在课前必须大量阅读与藻类植物相关的知识，特别是淡水藻类的一些知识。二、实验原理藻类植物是自然界中非常重要的一大类生物类群，它们不仅是用于科学研究的良好材料，在医药、食品、精细化工、环境保护、水产养殖等方面都有着广泛的应用。研究观察藻类不但有一定的理论意义，也具有重要的应用价值。淡水藻类以其生长环境不同可分成两类：一类是水生藻类；一类是气生藻类。三、实验材料、试剂与仪器设备显微镜、显微图像采集系统、采集瓶、培养瓶、吸管、镊子、刀、标签、记录本、浮游生物网等，相关工具书；4％的甲醛溶液、碘液四、实验步骤1淡水藻类标本的采集方法(1)水生藻类标本的采集水生藻类依其形体大小可分为丝状种类和微小浮游种类。丝状种类可用镊子采集。对固着于石块等物体上的藻可用刮刀将藻从基部刮下或连同附着物一起采集。将采集到的标本放入标本瓶中并加入一些水，但水不要加得太满，应留有一定的空间，标本瓶盖应注意密封，防止样品流失。标本瓶上要贴上标签，标签上须用铅笔注明该标本采集的地点、日期和采集者。浮游种类要用专用的浮游生物网采集，如无专用工具，也可用市售的300目尼龙筛绢对水体进行过滤，滤出的藻体可用少量水冲洗入标本瓶中。标本采集时还应用记录本记下各标本的采集环境、气温、水温、pH值、藻的附着基质、水体透明状况、藻体的手感是否滑腻等，这些都是鉴定藻类的参考条件。因此应注意详细记录。新鲜的藻标本不宜久存，应尽快对标本进行观察鉴定，好的标本可用4％的甲醛溶液（福尔马林溶液）固定保存。(2)气生藻标本的采集气生藻类多生长在阴湿的地面、墙壁以及树干的背荫面。这类藻可用小铲刀采集，用牛皮纸包好，风干后保存。对气生藻进行观察时，可用镊子镊取少许藻体，放在载玻片上，滴一小滴水浸润后在显微镜下观察形态。2几种常见藻类的采集、观察和保存(1)水绵在春秋季较清洁的水体中较常见，用手指捻摸有滑腻感，在显微镜下观察藻丝无分枝，叶绿体呈典型的螺旋带状，如在样品上加一点碘液（或碘酒）可见排列于叶绿体上的淀粉颗粒染成深褐色。鞘藻和刚毛藻也是很常见的丝状绿藻，与水绵不同的是这两种藻多生长于污染水体中。鞘藻不分枝但手摸无滑腻感，较老的细胞两端不等宽，进行有性生殖时形成大球形合子，易与水绵区分；刚毛藻手摸有粗糙感，藻丝分枝。(2)硅藻在雨后浅积水、小水沟等水质清澈的水体底部，呈棕色的表层中均有大量的硅藻生长，硅藻一般个体较小，显微镜下可见多为舟形，会缓慢滑动。(3)颤藻各种水体中均可见，以污水中较多，呈粘滑膜片状，深绿至黑褐色。显微镜下观察藻丝不分枝，细胞中仅见均匀小颗粒。(4)衣藻多出现于春秋季富含有机物的临时小水体中，可大量繁殖使水体呈绿色。在显微镜下观察，藻体游动，呈卵圆形，高倍镜下仔细观察顶端有两条等长鞭毛。衣藻标本固定一般用I2-KI溶液以防止鞭毛脱落。固定后的标本一般可保存数周至几个月。裸藻也是一种单细胞游动藻类，细胞为梭形，顶部一根鞭毛。(5)绿球藻生长于树皮上，呈绿色粉末状。显微镜观察为绿色圆球状。3对采集来的藻类植物进行分离、培养、鉴定和制作标本。本实验使用的藻类来自于自然水体，经过加营养盐(见表3-1)进行培养。表3-1营养液配方营养盐贮备液浓度g/L测试液最终浓度mg/L氯化铵1.515六水氯化镁1.212二水氯化钙1.818七水硫酸镁1.515磷酸二氢钾0.161.6*注：营养盐贮备液经过滤后4℃避光冷藏保存一般培养时间3-5天，如果室温过低，培养时间可增加到15天。培养期间隔2-3天，移出一半藻种培养液，加入新鲜培养液到原来的体积，进行培养。这样重复2-3次。培养方式采用静置培养，每天摇动3-4次，每次10分钟，其目的是使藻类处于悬浮状态，利于驯化和扩大培养。以上是一般藻类粗放的培养、保存方法。如要作较深入实验，需注意以下问题：①藻种的分离藻类培养首先要有藻种。从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离出来，而获纯种培养。这种方法称为藻种分离和纯化，又称纯培养法。真正的“纯种培养”是指在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。这是进行科学研究不可缺少的技术，而在生产性培养中不排除细菌的称之为“单种培养”。（1）采样和预备培养：首先要采集有需要分离藻类的水样，采回后在显微镜下检查。如发现需要分离的藻类数量较多时，可立即分离。若数量很少，最好先进行预备培养，待其增多后，再分离。用作预备培养的培养液，各种藻类是不同的，对一些难以培养的藻类一般加入土壤抽出液较好。预备培养液营养成分浓度应小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水样中藻类种类较多，就应使用几种不同的培养液，使藻类在适合于自己繁殖的培养液中繁殖起来。可用三角烧瓶或试管作培养容器，加入容量1/4～1/3培养液。然后把经筛绢过滤除去大型浮游生物的水样接种进去，放在合适温度下或室内靠北窗口下培养。在培养附着藻类时，容器可静止不动；而培养浮游藻类时，应该每天摇动一次。有的藻类在普通培养液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困难。此时需改变培养液浓度，加入葡萄糖、蛋白胨等有机物，补充微量元素和辅助生长物质，加入土壤抽出液，就有可能获较好效果。土壤抽出液制作方法：先在试管底部，加入高约1cm土壤（采用腐殖化的农田和庭院土）。再加入水使达5cm，塞上棉塞，采用蒸气间隙灭菌，每天灭菌1小时，连续二天。由于气泡上升，棉塞可能弄脏。因此，最好先在水中煮一段时间，使气泡跑掉后，再加棉塞进行灭菌。（2）分离方法：常用下列四种。1）微吸管（毛细管）分离选直径较细（约5毫米）玻管，在火焰上加热，待快熔时，快速拉成口径极细的微吸管。将稀释适度藻液水样，置浅凹载玻片上，镜检。用微吸管挑选要分离的藻体，认真仔细地吸出，放入另一浅凹载片上，镜检这一滴水中是否达到纯分离的目的。如不成功，应反复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中培养，一般在每个培养皿中接20～30个个体。从分离出少量细胞扩大培养到200毫升的培养量，如硅藻一般需20天以上。为了较长时期保存藻种，可将分离到的藻种用青霉素（1000～5000单位或链霉素（20ppm）处理后，获得较纯藻种。此法操作技术要求高，要细心。往往吸取一个细胞，要反复几次才能成功，且适于分离个体较大藻类。2）水滴分离法用微吸管吸取稀释适度藻液，滴到消毒过载片上，水滴尽可能滴小些，要求在低倍镜视野中能看到水滴全部或大部分。一个载片上滴2～4滴，间隔一定距离，作直线排列。如一滴水中只有几个所需同种藻类个体，无其他生物混杂，即用吸管吸取培养液，把这滴水冲入装有培养液并经灭菌试管或小三角瓶中去。如未成功，需反复重做，直到达到目的。此法简便易行，尤其适宜于分离已在培养液中占优势种类。分离受少量生物污染培养液中的藻类多用此法。操作时同样要求细致、认真，使用工具及培养液经严格消毒。3）稀释分离法把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。首先把水样稀释到每一滴含有一个左右的生物细胞（也可能一个都没有，也可能有两个），在稀释过程中配合显微镜检查，调节稀释度，然后准备装有1/4容量培养液的试管20支，每一试管加入稀释适宜水样一滴，摇匀，进行培养。待藻类生长繁殖达一定浓度时，再检查是否达到分离目的，若未达到，再重复做。此法操作简单易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分离法效果好。4）平板分离法这个方法的培养基制备和分离方法，与菌类的平板分离法基本相同，只是培养基配方不同。也可将稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（可使用医用喉头喷雾器），打开培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。接种后，盖上盖，放在适宜的光、温条件下培养。一般经过十余天，就可在培养基上发生互相隔离的藻类群落，通过显微镜检查，寻找需要的纯藻群落，然后用消毒过的接种环移植到另一平板培养基培养，也可直接移植到装有培养液并经过灭菌的试管或小三角烧瓶中，加消毒棉花塞子，进行培养。此法较繁，但难度不大，而且可看到是否污染杂菌，对于分离已污染杂菌培养液的藻类更合适。5）底栖藻的分离在显微镜或放大镜下挑取个体，一般可接种在固体培养基平板上，反复挑选、培养。6）分离浮游蓝藻可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分离硅藻则可利用其易沉淀的特性。用以上各种方法分离到藻种，需放在适宜光照条件下（靠南或北窗口附近光线充足处，但严防阳光直射）培养，有条件的可控制温度和利用人工光源。培养时，每天轻轻摇动1～2次，但需注意勿把培养液沾湿棉塞，避免杂菌污染。经一段时间后，培养物颜色逐渐变深。再经一次显微镜检查，如无其他混杂生物，才达到单种培养目的。②藻种的培养获得单种培养后，一方面扩大培养，另一方面可把藻种作较长时间保存，需要时随时取出使用。藻种培养要求比较严格，培养容器可用各种不同大小的三角烧瓶，容量有100、300、500、1000毫升，适于逐渐扩大培养。培养容器和工具需经煮沸灭菌或使用化学药品灭菌后，用煮沸水冲洗，培养液用加热灭菌法灭菌。按种后瓶口用灭菌纸包扎，放在适宜光、温条件下培养，每天轻轻摇动二次。大约二周后进行一次移植。藻种在培养过程中必须定期用显微镜检查，保持不受其他生物污染。③藻种的保藏可接在固体培养基上，在常温、弱光下保藏半年到一年；也可在低温下（冰箱内）保藏，每天接受短时间（几个小时）弱光，可保藏2～3年；如不照光，只能保藏几个月。保藏藻种所用培养基的营养成分浓度应比正常培养基高一些，一般可增加一倍，琼脂量为1～1.5％。也可在固体培养基上，再加培养液，然后接种到培养液中，可以避免固体培养基干涸，保藏效果比单用固体好。④培养液和培养基的配方配方极多，每种配方主要适用于一定藻种，这里介绍比较常用的几种：水生4号和克诺普（Knop）培养液，一般用于绿藻；蓝藻可用朱氏10号或水生105号无氮培养基（后者适于固氮蓝藻）；硅藻可用朱氏10号和水生硅1号培养基；另外还有海产绿藻、硅藻的培养基。常用培养基配方见表1。以上用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5％琼脂。从以上各种配方，可看到配制藻类培养液的几条原则：（1）要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等。（2）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等。（3）要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH。（4）要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括在土壤抽出液中）。（5）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。（6）要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。⑤大量培养过程包拈接种、培养、采收等。（1）接种：一般要求选取生活力强、生长旺盛藻种。可先将浓缩藻种用连续稀释法，制备一定浓度的悬浮藻液，然后接入培养容器。接种时注意藻种和培养液比例要适当，使藻细胞在新培养液中达到一定数量。使一开始培养，藻类在培养液中占优势，另一方面还可缩短培养周期，这是培养得到成功的经验之一。在环境条件不很适合情况下，更需提高接种量。一般所用藻种浓度，根据藻类体积大小，每毫升30万～300万个，采用1∶2～1∶5的比例。还需注意接种时间，在自然光条件下，最好在上午8～10时，不宜在晚上。尤其是能运动种类，此时明显向上浮游，接种时可把上浮优质藻类吸出做藻种，起选种作用。（2）培养管理：主要是使已接种培养物在相对稳定适宜环境中大量繁殖生长。要注意以下因素：1）二氧化碳浓度在开放式不通气方法培养中，搅拌是十分必要的，可以增加水和空气的接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，而且帮助沉淀藻类细胞上浮获得光照。在通气培养中，培养液内应维持二氧化碳浓度在0.1～5％之间。2