酶活性的测定

准确称取天山云杉种子0.1g，先加入1ml预冷的50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0，内含1mmol/LEDTA)，研磨成匀浆，然后用4.5ml分两次冲洗研钵至试管中，4℃，10000r/min离心20min，上清液即为酶提取液，4℃保存用于ROS系统酶活性分析。3酶活性的测定3.1过氧化物酶(POD，EC1.11.1.7)活性的测定。按照Chance和Maehly[6]的方法，并作如下修改:反应混合液为50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0，内含0.1mmol/LEDTA)2.9mL，2%H2O21.0mL，50mmol/L愈创木酚1.0mL。测定时，反应混合液先在25℃水浴中预热，立即加入0.1mL酶液以启动反应，以缓冲液调零，测定OD470值，每隔30s读数一次。取0—60s时间段，即1min反应时间来计算酶活性。以每分钟OD470增加0.01的酶量为一个酶活单位，U·g-1。计算公式:POD活性=ΔA470×Vt×(0.01×t×FW×V1)-1注:ΔA470:反应时间内吸光度的变化；Vt:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；FW:样品鲜重，g；t:反应时间，1min3.2过氧化氢酶(CAT，EC1.11.1.6)活性的测定。按照Aebi[7]的方法，并作如下修改:反应混合液为酶液0.2mL(空白管以失活的酶液代替)，50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0，内含0.1mmol/LEDTA)1.5ml，蒸馏水1.0ml。测定时，反应混合液和0.1mol/LH2O2预先在25℃水浴中预热。取反应混合液，加入0.1mol/LH2O20.3ml，终体积为3ml，测定OD240值，每隔1min读数一次，共读4min。以每分钟OD240减少0.1的酶量为一个酶活单位，U·g-1。计算公式:CAT活性=ΔA240×Vt×(0.1×t×FW×V1)-1注:ΔA240:A0－(A1+A2)/2；A0:对照管的吸光度；A1，A2:样品管的吸光度；Vt:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；FW:样品鲜重，g；t:反应时间，1min3.3超氧化物歧化酶(SOD，EC1.15.1.1)活性的测定。按照Giannopolitis和Ries[8]的方法，并作如下修改:反应体系:50mmol/L，pH7.8磷酸缓冲液3.0ml，130mmol/L甲硫氨酸0.6ml，750μmol/L氮蓝四唑0.6ml，0.1mmol/LEDTA0.6ml，酶提取液0.2ml(对照管以失活的酶液代替)，蒸馏水1.0ml，20μmol/L核黄素0.6ml。混匀后，将一支对照管放置暗处，其他各管置于30℃光照为4000lx日光灯下反应20min(要求照光情况一致，视酶活性高低适当调整反应时间)。至反应结束后，用黑布遮住试管，终止反应。以避光的对照管作为空白，测定各管OD560值。以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活单位，U·g-1。计算公式:SOD活性=(A0－As)×Vt×(0.5×A0×FW×V1)-1注:A0:照光对照管的吸光度；As:样品管的吸光度；Vt:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；FW:样品鲜重，g3.4抗坏血酸过氧化物酶(APX，EC1.11.1.11)活性的测定。按照Nakano和Asada[9]的方法，并作如下修改:反应混合液为50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0，内含0.1mmol/LEDTA)，0.5mmol/LASA。测定时，反应混合液和6mmol/LH2O2预先在25℃水浴中预热。取反应混合液2.9ml，加入酶液50μl，加入6mmol/LH2O250μl(终浓度为0.1mmol/L)以启动反应，终体积为3ml，以不加H2O2作空白调零，测定OD290值，每隔10s读数一次。取0—30秒时间段，即30秒反应时间来计算酶活性。以每分钟氧化1μmolASA的酶量为一个酶活单位，U·g-1·min-1。计算公式:APX活性=ΔA290×Vt×(2.8×t×FW×V1)-1注:ΔA290:反应时间内吸光度的变化；Vt:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；2.8:1mmolASA在290nm波长的消光系数；FW:样品鲜重，g；t:反应时间，0.5min3.5谷胱甘肽还原酶(GR，EC1.6.4.2)活性的测定。按照Halliwell和Foyer[10]的方法，并作如下修改:反应混合液为50mmol/L磷酸缓冲液,(pH7.5，内含0.1mmol/LEDTA)，5mmol/LMgCl2。测定时，反应混合液、10mmol/LNADPH2和10mmol/LGSSG预先于25℃水浴中预热。取反应混合液2.34ml，加入酶液450μl、10mmol/LNADPH260μl(终浓度为0.2mmol/L)及10mmol/LGSSG150μl(终浓度为0.5mmol/L)以启动反应，终体积为3ml，以缓冲液代替酶液调零，测定OD340值，每隔30s读数一次。取0—3.5min时间段，即3.5min反应时间来计算酶活性。以每分钟消耗1μmolNADPH的酶量为一个酶活单位，U·g-1·min-1。计算公式:GR活性=ΔA340×Vt×(6.22×t×FW×V1)-1注:ΔA340:反应时间内吸光度的变化；Vt:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；6.22:1mmolNADPH在340nm波长的消光系数；FW:样品鲜重，g；t:反应时间，3.5min3.6谷胱甘肽过氧化物酶(GPX，EC.1.11.1.9)活性的测定。按照黄爱缨[3]、Flohe[4,5]等的方法，并作如下修改:反应体系由1.0mmol/LGSH0.2ml(含2.5mmol/LNaN3)，酶液0.2ml组成，由37℃预热的1.5mmol/LH2O20.1ml启动反应，立即于37℃水浴中反应3min后，加1.67%的偏磷酸沉淀液(含2%EDTA-2Na,28%NaCl)2ml沉淀蛋白质，5000r/min离心20min，保留上清液。取上清液1ml(空白管加入双蒸水0.2ml和1.67%的偏磷酸沉淀液0.8ml)，加入0.32mol/LNa2HPO41.25ml及DTNB(5,5’-二硫对二硝基苯甲酸)0.25ml，反应5min，测OD422值。必要时也要测定样品本身的GSH(及其他-SH)的值。以单位鲜重(g)的植物样品，在37℃下，每分钟使GSH的改变为总量的0.001时为一个酶活性单位(扣除非酶反应的GSH)，U·g-1·min-1。计算公式:GPX活性=(A0－As)×Vt×(0.001×A0×t×FW×V1)-1注:A0:照光对照管的吸光度；As:样品管的吸光度；Vt:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液总体积，ml；FW:样品鲜重，g；t:反应时间，5min