小片段基因组文库的构建

实验小片段基因组文库的构建基因文库基因文库指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。根据文库所用的外源DNA的种类的不同基因组文库cDNA文库载体把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子（1）在宿主细胞内能独立复制。（2）有选择性标记。（3）有一段多克隆位点。外源DNA插入其中不影响载体的复制。（4）分子量小，拷贝数多。（5）容易从宿主细胞中分离纯化。常用的载体有5类：3.载体的种类质粒（plasmid）单链DNA噬菌体M13噬菌体的衍生物柯斯质粒（cosmid）动物病毒（virus）基因组文库载体P1噬菌体载体cosmid黏粒载体BAC载体（细菌人工染色体）PAC载体（P1人工染色体）YAC载体（酵母人工染色体）各种载体的比较载体容量（kb）宿主导入细胞方式黏粒30-45大肠杆菌转导P170-100大肠杆菌转导PAC130-150大肠杆菌电转BAC120-300大肠杆菌电转YAC250-400酵母转化基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。N=ln(1-P)/ln(1-f)P是希望得到的覆盖率，f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值，N是所需的克隆数。举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3x109bp,插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC克隆数为N=ln(1-0.99)/ln(1-[106bp/3x109bp])=-4.61/-3.33x10-6=138,298文库克隆数的确定基因组文库构建的基本流程：•基因组DNA片段的制备•载体的制备•将基因组DNA片段连接入载体•将重组载体转入宿主细胞。1．载体DNA片段的制备载体DNA分离纯化限制酶切脱磷酸化反应2．外源DNA片段的制备总DNA分离纯化分离特定大小DNA片段机械剪切法酶法部分酶切完全酶切3.供体与载体DNA连接要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的分子比率。4.重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化）5.基因组文库质量的评价1）文库规模----随机挑取一些重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。FosmidlibraryBAClibraryExperiment——小片段基因组文库的构建片段的来源根据实验要求选择片段的大小；•酶切产物直接回收（酶的使用与载体要一致）•酶切产物PCR扩增（T载体）载体的选择质粒载体考虑因素pMD-18Tvector0.5μlsolutionⅠ5.0μlinsertDNAfragment4.5μl(AFLP预扩增产物）连接16℃连接8h1.10μl连接产物加入到100μl感受态细胞悬液中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置30min。2.将管放到预加温到42℃的循环水浴中，恰恰放置90s，不要摇动。3.快速将EP管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。4.每管加400μlLB培养基，然后放于37℃摇床上，30min，使细胞复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。5.在加有氨苄的固体LB培养基平板上涂40μlX-gal和4μlIPTG6.取250μl已转化的感受态细胞涂到已处理的平板上涂板均匀。7.将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养，12-16h后可出现菌落。转化用牙签挑取白色菌落到加有4mlLB培养液（含有0.1%氨苄）中，在37℃摇床中摇10h。挑菌插入片段大小检测质粒酶切1.将已摇好的菌液加入1.5ml离心管中10000rpm30s离心，去除上清液，重复一次，用移液器将残留的培养液吸出；2.在离心管中加入150μlSolutionⅠ（50mM葡萄糖，25mMTris-HCl,10mMEDTA),用移液器吹打使沉淀悬浮。3.新鲜配制SolutionⅡ（0.2MNaOH,1%SDS),加300μlSolutionⅡ到上述管中，缓慢颠倒混匀，冰浴5min。4.加225μlSolutionⅢ（5MKAC，冰乙酸）到上述管中，混匀，冰浴5min5.以10000rpm离心5min，取上清于新的EP管中，加等体积氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心5min6.取上清，加入2/3体积异丙醇，颠倒混匀后在-20℃下放置10min，10000rpm离心5min，去上清7.用75%乙醇洗沉淀1次后，在超净工作台中吹干，加10μlddH2O溶解.Plasmid10μl10×Hbuffer2μlEcoRI1.0μlPstI1.0μlRNase0.5μlH2O5.5μl37C酶切过夜，0.8%琼脂糖电泳检测思考题1影响文库连接效率的因素包括哪些？2文库质量检测包括哪些方面？3质粒提取中过程中溶液I,溶液II,溶液III的作用分别是什么？