大肠杆菌感受态的制备

实验三大肠杆菌感受态的制备【实验目的】通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。【实验原理】体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。研究发现，用含Ca2+的溶液处理大肠杆菌细胞会使细胞易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCl2法。CaCl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，之后通过转化实验检测感受态细胞的转化效率。【实验步骤】1.第一天晚上：用枪头沾取大肠杆菌DH5α菌液，在不加入抗生素的LB平板上划线，37℃过夜培养。2.第二天晚上：挑取一DH5α单菌落于2mL液体LB培养基中，37℃过夜震荡培养。3.第三天早晨，取其中1ml菌液于一含100mLLB培养基的锥形瓶中，37℃振荡培养2-3h至OD600在0.3-0.5之间4.4℃，3,500rpm，离心10min，回收细胞。4.取30mL菌液置于冰浴好的离心管内，冰上放置10min，4℃3500rpm离心10分钟。5.倒出培养液，每管菌体悬浮于3mL（1/10）MIXⅠ（务必放冰上），4℃3500rpm离心10min，回收细胞。6.每管菌体悬浮于600μL（1/50）MIXⅡ，（务必放冰上）分装成100μL，4℃保存。【结果与分析】OD600=0.380，介于0.3和0.5之间，处于对数期，可以进行后面试验。此实验一定防止杂菌和DNA的污染，保证无菌，所用的离心管枪头和试剂都要经过灭菌，同时要防止DNA酶和杂DNA的污染，否则均会影响转化效率和杂DNA的转入。同时所用的所有试剂和离心管都要要在低温下冰上预冷。此过程中感受态细胞的制备过程要尽量避免用力震荡，在用枪头吹起悬浮时要轻，切忌用力来回吹打，以免破坏细胞，因为此时的大肠杆菌细胞已膨胀。