山羊抗小鹅瘟高免血清的制备及临床试验

山羊抗小鹅瘟高免血清的制备及临床应用试验王文强1，王开功2，田新平3（1.铜仁职业技术学院，贵州铜仁554300；2.贵州大学动物科学学院，贵阳花溪3.550025；铜仁市畜牧兽医局，贵州铜仁554300）摘要小鹅瘟是雏鹅感染鹅细小病毒(Gooseplaguevirus，GPV)，所引起的一种急性败血型传染病。本病病程短而且死亡率高，主要侵害1月龄以内的雏鹅和雏番鸭。10日龄以下的雏鹅发病后，其死亡率可能高达100%。目前，许多养鹅场大多使用市场上销售的抗小鹅瘟血清对鹅进行免疫和治疗，但是市场上销售的抗小鹅瘟血清其产量低、成本高，且容易导致某些鹅源疫病的传播。本文采用从贵州麻江县等地的养鹅场采集的病鹅分离出的小鹅瘟野生强毒株接种于9日龄的鹅胚尿囊液制备了小鹅瘟病毒抗原，并用小鹅瘟病毒抗原加弗氏佐剂后，分多次皮下注射结合静脉注射小鹅瘟病毒抗原免疫贵州黑、白山羊。颈动脉一次性放血制备抗小鹅瘟异源高免血清，用琼脂扩散进行效价的测定，结果显示其抗体效价平均都在1∶8以上。将制备的血清与市售的抗小鹅瘟进行了对比试验，结果市售的抗小鹅瘟血清的保护率为85%，山羊抗小鹅瘟高免血清的保护率为95%。山羊抗小鹅瘟异源高免血清具有效价高、成本低、安全性好等优点。关键词：小鹅瘟；山羊抗小鹅瘟高免血清；抗小鹅瘟血清；对比试验小鹅瘟又称为Derzsy’s病、鹅流感、鹅肝炎、鹅传染性心肌炎、鹅肠炎、鹅腹水性肝肾炎，它是由小鹅瘟病毒（Gooseplaguevirus)，即鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)引起小鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性、败血性、高度接触性、传染性强、病程短且死亡率高的传染病[1-4]。根据《贵州畜疫病志》和贵州大学王开功教授[9]报道，2001年3月，贵州省惠水、三都、修文等县的养鹅场雏鹅发生了一种疫病，病鹅的临床症状和病理变化与国内的殷震和国外的GoughR.E等人[10-14]报道的小鹅瘟很相似。贵州大学动物科学学院疫病实验室对从患病的鹅群中采集的病鹅心、肝和脾等组织触片染色镜检未见细菌，同时接种血琼脂平板作需氧和厌氧培养，结果为阴性。随后将病料进行处理接种于15日龄鹅胚尿囊腔，分离到一株小鹅瘟野生强毒，同时证明了贵州省已经有本病的存在。随着贵州省养鹅业的迅猛发展，小鹅瘟的发生和流行，对贵州省的养鹅业造成了巨大的威胁。大多数养殖场鹅病的发生集中在每年的3～4月份；3周龄的小鹅易发病；发病率为80%，死亡率高达90%～100%。虽然一些主要的养鹅场对一日龄的小鹅用抗小鹅瘟血清进行了免疫，但是随着鹅体内抗体的消长和许多养殖场种鹅的免疫程序还不完善，小鹅瘟还是存在着威胁。应用高免鹅制备的血清可以对小鹅瘟进行很好的预防和治疗，但是由于利用成年鹅制备高免血清产量低而且成本很高,难以满足生产上的需要。所以我们从生产实际出发，参考了国内外的一些经验和技术，用从养殖场的病鹅分离出的小鹅瘟毒株，将病毒接种鹅胚进行病原的增殖，收集到的尿囊液，制作了小鹅瘟病毒抗原，采用多次免疫和颈动脉一次性采血的方法制造出了适合我省预防和治疗小鹅瘟的山羊抗小鹅瘟异源高免血清，并与中牧实业股份有限公司成都药械厂生产的抗小鹅瘟血清进行了对比试验。对防治鹅细小病毒感染的发生和流行，保障贵州省养鹅业的健康发展具有重要的意义。1材料与方法1.1材料1.1.1毒株用从贵州省惠水、三都等县的养殖场的病鹅采的心、肝、脾等病料分离出了小鹅瘟野生强毒株，由本实验室冻干保存。1.1.2胚胎9日龄的鹅胚由实验室购自乌当养殖场未经免疫的鹅蛋在本实验室自行孵化。1.1.3样本小鹅瘟标准抗原和阳性血清由扬州大学动物医学系王永坤教授惠赠；免疫鹅血清系采用小鹅瘟弱毒疫苗人工免疫成年鹅制备；其它常见禽病血清如新城疫病毒(NDV)、马立克病毒(MDV)、减蛋综合症病毒(EDSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)均由本实验室提供；禽流感病毒（AIV）血清购自哈尔滨兽医研究所。1.1.4试验用山羊购于清镇养羊场，一头贵州黑山羊和一头贵州白山羊，体重30kg以上,临床检查健康。1.1.5试验用雏鹅由铜仁市川主科技助农有限公司提供。1.1.6抗小鹅瘟血清中牧实业股份有限公司成都药械厂生产，生产批号为兽药生产（2007）220058090。1.2方法1.2.1小鹅瘟抗原的制备取病毒感染鹅胚的尿囊液，经4000rpm离心10min,去除细胞碎片，收集上清液。于上清液中加入等量氯仿，强烈振摇，经4000rpm离心10min，舍去有机相和中间界面的杂质，收集上层水相。反复抽提3～4次，直至两相界面清晰。在水相中缓慢加入质量浓度400g/L的聚乙二醇（MW6000），使其终质量浓度达60g/L，调节氯化钠的质量浓度达22g/L，4℃静置过夜，第二天后经过10000rpm离心30min,舍去上清液，收集病毒沉淀物。取0.01mol/L的PBS(pH7.2)适量悬浮病毒沉淀，加入0.1%的甲醛灭活后，即为尿囊液病毒抗原。正常鹅胚尿囊液的抗原制备同上述试验方法。1.2.2小鹅瘟抗原的检测扬州大学提供的小鹅瘟诊断抗原、本次试验制备的尿囊液病毒抗原、正常鹅胚尿囊液抗原,分别与小鹅瘟阳性血清、免疫鹅血清、PBS作琼脂扩散试验。同时取小鹅瘟病毒抗原分别与GPV、NDV、MDV、AIV、EDSV、IBDV的血清进行琼脂扩散试验。1.2.4山羊抗小鹅瘟高免血清的制备与检验1.2.4.1山羊的免疫每头山羊第一次皮下注射4ml病毒液—弗氏不完全佐剂的小鹅瘟油佐剂疫苗；7天后进行第二次注射，每头山羊皮下注射4ml病毒液—弗氏完全佐剂的小鹅瘟油佐剂疫苗；再过7天后进行第三次注射，每头山羊颈部皮下注射小鹅瘟抗原4ml/只；过7天后进行第四次免疫，每头山羊颈静脉注射小鹅瘟抗原4ml/只。每次注射之前都要抽血检验抗小鹅瘟高免血清的效价。1.2.4.2抗小鹅瘟血清的制备按照免疫程序完成的山羊，经过采血检验血清效价达到规定标准时采血。一般血清抗体效价高峰在最后一次免疫后的7~11天。采血前一天不喂饲料，只喂饮水，并在上午空腹的时候采血，以防血脂过高。采血时是在无菌环境下采用颈动脉一次性放血，以免所制备的血清受到污染。将收集到的血液静置于室温下等待其自然凝固析出血清。血清没有完全析出的可以将血液置于4℃冰箱内让其完全析出。将分离的血清用离心机离心10000rpm离心10分钟，分离的血清加生理盐水稀释使稀释后血清抗体效价达到1∶6,然后每毫升血清加青霉素、链霉素各1000IU,再按0.1‰加入硫柳汞,充分振荡摇匀,分装于灭菌瓶中密封,贴上标签。保存在-15℃冰箱中备用。1.2.4.3抗体效价测定琼脂板制备：称取1g琼脂粉，加至100ml8.5%的高渗盐水中，煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至55℃左右的时候浇玻璃平板，每个平板浇灌的琼脂厚度约为2mm，待琼脂平板完全凝固后，用打孔器在琼脂凝胶上打梅花孔，打孔之前先用一张纸做好样本后垫在琼脂平板下面，孔径为2mm，中间孔和周围孔间的距离大约为3mm。打完孔之后将琼脂平板在酒精灯上加热封底。在第四次免疫后的第七天，自颈静脉按10mL/只采血。用离心机分离血清后，将小鹅瘟高免血清作2倍比稀释，按照1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等进行稀释，将稀释的血清分别加至周围孔中，中间孔加小鹅瘟琼扩抗原，每组还要在周围孔加标准的阴性和阳性血清对照。加完样后将琼脂平板置于湿盒内，37℃放置24~48小时后观察，结果显示贵州黑山羊和贵州白山羊的抗体效价平均都在1∶8以上。1.2.5山羊抗小鹅瘟高免血清的安全试验试验之前先对血清进行无菌检验，取1ml的抗小鹅瘟高免血清，接种于新鲜血琼脂培养基上，经过37℃培养24小时，观察有无细菌的生长，结果为阴性时才可以用。选择1日龄小鹅16只分为四组，腹腔注射组，腹腔注射对照组，皮下注射组，皮下注射对照组，每组4只，腹腔注射组注射高免血清0.4mL/只，腹腔注射对照组腹腔注射生理盐水0.4mL/只。皮下注射组皮下注射高免血清0.6mL/只，皮下注射对照组皮下注射生理盐水0.6ml/只，注射后观察小鹅有无异常反应，并连续观察20天。1.2.6小鹅瘟病毒半数致死量的测定将病毒悬液加PBS进行10倍稀释，制成10-1的小鹅瘟病毒稀释液。随后将10-1的稀释液稀释成10-2、10-3、10-4不同稀释度的病毒。具体操作如下：取3支灭菌试管排列于试管架上，并放于冰槽中，每一支试管内加4.5毫升灭菌的PBS，用无菌的注射器吸取10-1的小鹅瘟病毒稀释液0.5毫升，加入第1支试管内，弃去此注射器，将第1管内的液体混匀，成为10-2病毒稀释液；又取一注射器吸取10-2的病毒稀释液0.5毫升，加入第2支试管内，使成10-3病毒稀释液；根据这种做法稀释10-4的小鹅瘟病毒稀释液。然后将所得的各种稀释度的小鹅瘟病毒感染3日龄的雏鹅，由用原病毒感染开始，每个稀释度感染雏鹅10只。每只雏鹅接种小鹅瘟病毒0.2ml/只。观察15天，记录雏鹅死亡的数量。1.2.7对比试验1.2.7.1试验用的材料取体重相等的一日龄雏鹅60只、用小鹅瘟病毒在鹅胚上传四代收集的尿囊液、生理盐水（六枝工矿集团大华药业有限公司）、本实验室研制的山羊抗小鹅瘟高免异源血清、市售抗小鹅瘟血清（中牧实业股份有限公司成都药械厂生产；预防量：0.5ml/只；治疗量：1～1.5ml/只）、注射用青霉素钠80万单位（中诺药业石家庄有限公司）、注射用硫酸链霉素100万单位（济宁市洸府兽药厂）、一次性注射器10ml、2.5ml、1ml的若干个。试验之前先将购买的生理盐水加热煮沸6分钟，冷却后备用。1.2.7.2小鹅瘟病毒尿囊液的稀释用10ml的一次性注射器抽取10ml尿囊液加90ml生理盐水稀释10倍；在稀释10倍的尿囊液中加青霉素、链霉素各1000单位每毫升。用1ml的一次性注射器抽取1ml尿囊液加生理盐水100ml稀释100倍；在稀释100倍的尿囊液中加青霉素、链霉素各1000单位每毫升。1.2.7.3操作过程选体重相等的1日龄雏鹅60只，随机分为（A、B、C）3组每组20个。分组后将雏鹅隔离饲养，每组再分两小组，每组10只，并用红油漆做好标志。用红外灯炮给小鹅保温。A组全部腿部皮下注射抗小鹅瘟血清0.6ml/只；B组全部腿部皮下注射山羊抗小鹅瘟高免血清0.6ml/只；C组全部腿部皮下注射生理盐水0.6ml/只。第二天对每组的第1小组的小鹅皮下注射稀释10倍的尿囊液0.2ml每只；每组的第2小组皮下注射稀释100倍的尿囊液0.5ml每只。观察每组小鹅的发病情况和死亡数量，观察20天。2结果与讨论2.1结果2.1.1小鹅瘟病毒的传代增殖的结果用小鹅瘟野生强毒XW株通过在鹅胚上传四代，收集了48～96小时死亡的鹅胚尿囊液后，将胚体取出和正常的同日龄的鹅胚进行对照，结果见表2.1。对收集的尿囊液做的细菌检验，结果都为阴性。表明接种的胚体不是因为细菌感染死亡，而且收集的尿囊液没有细菌的生长。多数感染鹅胚死于72～96小时之间,未接种病毒的对照组鹅胚健康存活。与对照鹅胚相比较,感染胚的肝由红褐色变为土黄色,严重病例可见坏死灶;心肌色泽变淡,甚至显现瓷白色。胚胎发育阻滞,胚体充血出血,这是禽类病毒感染胚胎的普遍现象;“肝土黄色,心肌苍白”是小鹅瘟病毒感染胚胎的特征性病变。全部收集的尿囊液用鸡红细胞做了血凝实验均未显示出血凝特性,表明分离的毒株,没有污染禽副黏病毒。3只鹅胚在18~24小时内死亡是因为在接种尿囊液的时候针头不小心刺破血管和胚体，导致鹅胚的死亡。表2.1小鹅瘟野生强毒经鹅胚增殖的结果代次接种数死亡数死亡率（%）死亡时胚胎病变血凝细菌检验间（d）F1221985.0（17/20）2~4发育阻滞——F2201579.0（15/19）2~4胚体出血——F32525100（25/25）2~4心肌苍白——F42828100（28/28）2~4肝土黄色——注：“—”表示无血凝现象；无细菌生长。有3只鹅胚在18~24小时内死亡。2.1.2尿囊液中病毒抗原的检测结果采用小鹅瘟阳性血清、免疫鹅血清、PBS分别检测本次试验制备的小鹅瘟病毒抗原、正