契达干酪贮存期间蛋白变化的研究

契达干酪贮存期间蛋白变化的研究郭奇慧呼和浩特市罗家营高职园区（大学城）内蒙古商贸职业学院工程系呼和浩特010070摘要：在契达干酪贮存期间，对其总蛋白、水溶性蛋白、非蛋白氮、游离氨基氮含量进行测定。结果表明，随着贮存时间的延长，水溶性蛋白/总蛋白、非蛋白氮/总蛋白、游离氨基氮/总蛋白变化极显著（P0.01）；贮存时间与水溶性蛋白/总蛋白、非蛋白氮/总蛋白、游离氨基氮/总蛋白间均呈极显著正相关（P0.01）。关键词：契达干酪；蛋白变化StudyonproteinchangeofcheddarcheeseduringstorageGUOQi-huiInnerMongoliabusiness&tradevocationalcollege,Huhhot,010070,ChinaAbstract:Duringstorage,thetotalnitrogen(TN),watersolublenitrogen(WSN),nonproteinnitrogen(NPN),freeaminonitrogen(FNA)inthecheddarcheesewereanalyzed.TheresultsshowedthattheWST/TN,NPN/TNandFAN/TNincreasedduringstorage(P0.01);highercorrelationcoefficient(P0.01)wasfoundduringtheWST/TN,NPN/TNandFAN/TN.Keyword:cheddarcheese;proteinchange引言干酪（cheese）是以乳、稀奶油、脱脂乳或部分脱脂乳、酪乳或这些原料的混合物为原料，经凝乳酶或其他凝乳剂凝乳，并排除部分乳清而制得的新鲜或发酵成熟的乳制品（FAO/WHO）[1]。干酪是一种有着不同风味和质地的发酵乳制品，广泛分布于世界各地。是人类饮食的重要组成部分之一。干酪是一种古老的乳制品，据文献记载其品种达2000种，其中较为著名的品种有400多种，是乳制品中品种最为丰富的。[2]干酪的生产伴随着整个中东文明的发展，在罗马时代已经有了很完善的干酪生产工艺。罗马军队和统治者四外征战，使得干酪传遍世界各地。在罗马帝国衰落后，人们向欧洲迁徙，这就促进了干酪工艺的普及。在中世纪真正促进干酪技术和干酪种类发展的是修道院和封建部落。许多现代干酪都是在修道院中发展起来的。中世纪的封建部落都是自给自足的。剩余的食品保存起来供全年食用。这就为干酪的制作创造了条件。欧洲的殖民者也把他们的干酪技术带到了他们的殖民地，如南北美、非洲等地区。最初通过乳中酸度的增加来使酪蛋白形成凝块，后来，人们发现新生哺乳动物胃中的酶也可以使酪蛋白凝结。今天，人们也使用微生物和植物来源的酶来制作干酪。用凝乳酶制成的干酪在储藏期间，各种细菌继续生长，凝乳酶也继续起作用。同时在储藏期间干酪的结构和风味也不断变化，这一过程称为干酪的成熟过程。随着人们对乳和干酪的理化性质和微生物的不断了解，干酪生产过程中人为控制的可能性也不断增大。通过人为的改变干酪工艺可以生产出更多的新型干酪，而延续下来的品种的质量也变的更加稳定。干酪相当于将原料乳中的蛋白质和脂肪浓缩了10倍左右，含有乳中的全部营养成分，另外，在干酪成熟过程中微生物的代谢活动将大分子的营养物质降解成小分子的营养成分，从而更利于人体吸收利用，其中某些化合物具有明显的保健功效，因而干酪具有较好的功能性。干酪中的蛋白质以酪蛋白为主，含有所有种类的人体必须氨基酸。酪蛋白在发酵成熟过程中经凝乳酶、发酵剂及其它微生物蛋白酶的作用，逐步被分解形成胨、大肽、小肽、氨基酸以及其它有机或无机化合物等小分子物质。这些小分子物质很容易被人体吸收，使干酪的蛋白质消化率高达96%～98%。干酪中还含有大量的必需氨基酸，其含量完全满足人体正常代谢的需要，与其他动物性蛋白比较质优而量多。[1]在干酪成熟过程中，少量的脂肪发生水解，生成多种挥发性脂肪酸，其中共轭亚油酸的含量可以达到3.6~7.1mg/g脂肪，而最近研究表明共轭亚油酸的异构体能明显降低人体心脏病和某些癌症的发病率，提高人体免疫系统功能，均衡人体重量和脂肪含量的比例。[3]因为干酪工艺中有发酵步骤，所以食用干酪不会出现乳糖不耐受症和蛋白质过敏反应，而且蛋白质的消化率和生物学价值极高。可以说，干酪是营养价值极高的食品。除了直接食用外，还可以作为儿童营养食品和老年人保健食品的优选原料。[4]另外干酪中还含有糖类、有机酸、钙、磷、钠、钾、镁微量矿物元素，铁、锌以及脂溶性维生素A，胡萝卜素和水溶性维生素B1、B2、B6、B12、烟酸、泛酸、生物素等多种营养成分。是典型的高营养低热量的健康食品。[3]契达干酪是以牛乳为原料，经细菌成熟的天然硬质干酪，是世界上比较著名的干酪品种之一。这种干酪原产于英国cheddar村，因而得名。契达干酪成品水分39%以下，脂肪含量在32%左右，脂肪占总干物质含量的42%以上，蛋白质25%，食盐1.6-1.8%[1]。第1作者简介：郭奇慧，1980年生，女，硕士，研究方向为乳品化学与工艺学目前契达干酪在美国产量最大，其他国家也有生产，由于地域影响和市场偏好，发展出了许多稍有不同的契达干酪品种，如传统的英国式、新西兰式、美国式和加拿大式契达干酪[2]，但有一点是相同的，即所有的这些干酪都在生产中经历了堆积工艺（cheddaring），正是这种特殊的工艺赋予了这种干酪独特的质地和功能性。堆积是指对凝块进行加压，这个工艺在很大程度上促进了干酪微观颗粒之间的凝聚和融合。传统上，堆积是将乳凝块反复压成片状并聚堆的过程。堆积是延用至今的契达干酪工艺中不可缺少的程序[3]。干酪成熟是指人为的将新鲜干酪置于较高或较低的温度下，长时间存放，经微生物和酶的作用，使新鲜的凝块转变成具有独特风味、组织状态和外观的过程。在成熟过程中干酪凝块中的微生物或酶水解蛋白质、乳糖以及其他成分，使不溶性的蛋白质转变成可溶性的多肽形式，部分脂肪转变成脂肪酸和甘油，形成柔软、有韧性的质地和清香的风味。成熟过程中干酪内部的氧很快被微生物耗尽，乳糖也很快被转变为其他成分，使成熟干酪中乳糖含量甚微。成熟过程会有大量水溶性物质产生，如肽、氨基酸、胺、脂肪酸以及羰基化合物，这些成分以某种特有的数量和比例存在，从而构成了成熟干酪的典型风味。干酪凝块在成熟过程中的变化，涉及蛋白质、脂肪和乳糖变化，这些都促进了干酪风味的形成，是干酪成熟的重要意义。蛋白质的水解是干酪成熟过程中的重要变化。作用主要表现在三个方面：其一，对风味的直接贡献，如肽、氨基酸。氨基酸是形成其他风味成分和芳香成分的源头。这类源头氨基酸主要有：天冬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、丝氨酸等。其二，氨基酸是凝乳蛋白在多种酶作用下的最终产物，故蛋白质水解后生成氨基酸的量是干酪成熟程度的标志。其三，由于NH3的形成，使得干酪pH上升，不但加速干酪的蛋白质水解，而且提高了其组织质地和口感。所以蛋白质水解是大多数种类的干酪成熟过程中最重要的过程[4,5,6]。本试验的目的是通过开展契达干酪与蛋白变化对应关系调查，寻求其中的规律，并据此及时反应出契达干酪的质量情况，可为乳制品的生产加工提供及时准确的指导信息，及时采取控制措施，避免经济损失。1材料与方法1.1材料鲜牛乳；发酵剂，由乳酸链球菌（Str.lactis）和乳油链球菌（Str.cremoris）组成，丹麦汉森公司生产；凝乳酶，活力1：33000，丹麦汉森公司生产；色素，安那妥，丹麦汉森公司生产。根据契达干酪制作工艺，制成契达干酪，并将包装好的干酪置于冷藏柜（温度8～12℃）中，成熟6个月。1.2总蛋白的测定凯氏定氮法[7]。在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。具体步骤如下：样品消化：准确称取均匀的样品3g,小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入1g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45°角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗，继续加热0.5h，冷却至室温。蒸馏、吸收：冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml40g∕L硼酸溶液及混合指示剂5～6滴）。在凯氏烧瓶内加入100ml蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢加入70ml400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。滴定：将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白。最后计算样品中总蛋白含量。1.3水溶性蛋白的测定[8]在干酪成熟第1，15，30，60，90，120，150，180天分别取样，样品重5.0000g，加10mL蒸馏水，匀浆（6000转/分钟）1分钟。定容于100mL容量瓶中，混合物在50-55℃条件下保温0.5小时，并时时摇动，然后离心（8924g/分钟）20分钟。取上清液1mL，凯式定氮测其含量。1.4非蛋白氮的测定[9]在干酪成熟第1，15，30，60，90，120，150，180天分别取样，样品重2.0000g，加10mL质量分数为12%的TCA溶液，匀浆（6000转/分钟）1分钟，移入100mL容量瓶中，用12%的TCA定容到100mL，放置一夜，离心（8924g/分钟）20分钟。取上清液1mL，凯式定氮测其含量。1.5游离氨基氮含量测定游离氨基氮的测定采用邻苯二甲醛衍生比色法，参照Church等[10]的方法，在440nm下用分光光度计（UV-1700Shimadzu）测定吸光值，确定游离氨基氮含量。邻苯二甲醛衍生试剂的配制：精确称取40mg邻苯二甲醛（分析纯）溶于1mL甲醇中，加入25mL100mmol/L四硼酸钠，2.5mL10%SDS，100μLβ-巯基乙醇，加水定容至50mL。现用现配。标准的制备：L-苯丙氨酸的水溶液，浓度分别是：0、50、100、250、500、1000、1500、2000μmol/L。样品的处理：准确取5.00mL样品，加入12%（0.75N）的三氯乙酸10.00mL，加入1mL蒸馏水，振荡摇匀，4℃离心（12000g/分钟）15分钟（EPPENDORF5810R型台式高速冷冻离心机）。清液备用。FAN测定：取干酪成熟第1，15，30，60，90，120，150，180天样品各1g，加10mL蒸馏水，用匀浆机（6000转/分钟）1分钟捣碎，定容至50mL，1小时后，取上清液5mL，加1mL水和10mL0.75mol/LTCA旋转混合，10分钟后4℃（12000g/分钟）离心10分钟（高速离心机），测定其吸光值。1.6统计分析利用SAS软件（V9.00）对数据进行分析。2结果分析2.1契达干酪贮存期间蛋白变化的差异性研究根据契达干酪储存的时间，把样品分成八组（分组情况见表1），每组各指标计算平均数，对WSN/TN、NPN/TN、FNA/TN的差异性和相关性进行分析，结果见表1。表1：契达干酪贮存期间的蛋白变化Tab.1Theproteinchangeforcheddarcheeseduringstorage注：*表示差异显著性,**表示在0.01水平下显著；A、B、C、D、E、F、G、H表示各组间差异从表1分析可知，契达干酪在成熟过程中WSN/TN、NPN/TN、FNA/TN随贮存时间的延长而增加，经统计学分析后发现WSN/TN、NPN/TN、FNA/TN组间有显著差异（P0.01），说明蛋白水解过程中小肽和中肽都在持续增加[11]。FAN测定对象是蛋白质降解成的小分子的短肽类和氨基酸。在成熟过程中契达干酪FAN在持续增加。说明契达干酪在成熟过程中，蛋白质降解程度高，释放出的短肽类、氨基酸等小分子多。干酪成熟过程中蛋白质的水解主要由干酪中的酶类引