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细胞培养的流程,从购买试剂、分装,到无菌操作、实验、观察的过程?对于新手来说,细胞培养真是太难了,很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到,因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌,试剂的购买、配制、分装,细胞的分离,无菌操作,培养细胞的观察,实验的设计,及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高,要求非常严格。如果你正在培养细胞,或曾经培养过细胞,你一定有很多的经验值得大家分享,你一定有你自己的一套培养细胞的流程,从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此,你不妨说说你的细胞培养流程,以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。于此,我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者!有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错,我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了,解决困难耗费了大量地时间,可惜呀!养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程,作起来不易,要真正详细的写出来示人更难!书上的规范和标准很多,但作起来每人都有自己的方法,适宜就好。我看还没有人跟帖,我就先说一点,从最初阶段开始:(自己的做法)(一)仪器的清洗总的分为两大类:可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液(由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液)可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子,离心管等塑料器皿。消毒过程:自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜(不少于6h)----→自来水冲洗15-20遍----→蒸馏水洗3-5遍,烘干备用。不可泡酸的主要是胶塞和盖子,虑器等,先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜,自来水冲洗,5%HCl濅泡三○min,流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。消毒好的器具一定找个干净的柜子保存,使用前高压消毒灭菌,我科室主要使用铝制饭盒分装器具,挺方便的,用前高压。今天暂说一点,以后有机会再续,望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道,现在知道为什么没有别的战士跟贴了么?我怎么也耗了几十分钟打的字,你就这样打击别人的信心,还有可能往后面延续么!再说,经验何止这些这点......您的帖子我看见了,您的抱怨我也接受!并且跟您补上一分!每个斑竹给分的标准有一定的差别,但是可以肯定的是:我们有自己的加分原则,大原则是不变的!比如:版内讨论得很多的东西,重复发帖一般不予以加分!您的这个帖子属于改范畴!感谢您对细胞版的支持!如果有问题可以直接pm我们!再次感谢!再多说点啊!呵呵接着说呀,很好,很有帮助,我是新手,要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。1、首先说清洗:对于玻璃器皿(如移液管、盖玻片之类)可先用酸液浸泡24h以上,再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍,除去残留酸液,再用双蒸水冲洗3-5遍,彻底洗净后放入不锈钢筒中,双层牛皮纸扎口,高压灭菌20min,烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液(重铬酸钾120g浓硫酸200mL蒸馏水1000mL)配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净,临用时再次用清水冲洗3-5遍,再用双蒸水漂洗3次,洗净后瓶口盖上锡箔纸,外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min,与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子,也要在用完后及时洗净、灭菌时保持密封。Tip头就容易了,插到盒子里,双层牛皮纸包好后直接高压灭菌就好了。2、再说说除菌:我说的除菌主要是指溶液的除菌。如PBS、HEPES之类的一些缓冲剂和不含葡萄糖的盐溶液,可以配好以后直接高压灭菌。而大部分的溶液由于成分限制必须过滤除菌。我们实验室需要过滤除菌的溶液有:胶原酶、胰酶、各类血清、抗生素、G-418溶液、各类培养基、各类生长因子、丙酮酸钠、谷氨酰胺等.3、关于各类溶液的配制:我列出我们实验室常用试剂的配方吧:1XPBS:氯化钠8克、氯化钾0.2克、磷酸二氢钠1.15克、磷酸氢二钾0.2克,加水至一升,调pH=7.4。这里我认为PBS的pH是最重要的一环,不可大意。HEPES溶液:8克氯化钠、0.3克氯化钾、0.135克磷酸氢二钠、1克葡萄糖、5克HEPES加水900ml,调pH=7.4抗生素:我们主要用青霉素和链霉素,一般用1XPBS稀释至1X105单位,-20度储存,用时直接加入培养基,工作浓度一般为1X102单位。G-418:1克包装的G-418瓶中加入10mlHEPES溶液彻底溶解,过滤除菌后分装于EP管,-20度保存。谷氨酰胺:L-谷氨酰胺29.2克,加Hanks‘BBS1000ml溶解,配成200mmol/L过滤除菌,4度保存,工作浓度1~4mmol/L。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。1XEDTA-胰酶:0.25克胰酶加0.1克EDTA完全溶解于500ml1XPBS中,过滤除菌后分装于50ml离心管中,一管4度备用,其他-20度保存。我不太主张配成10X的母液,因为胰酶反复冻融后,效果会差很多。(EDTA很难溶,必要时候可放置过夜)MTT:sigma公司出产,用1XPBS配成50mg/ml待用。MTT毒性很大,配置时务必小心。各类培养基:现在我们实验室都是买GIBICO的粉剂自己配制。包装盒上会有配制方法,以及加碳酸氢钠的量。按说明来就是了。需要注意的是在配培养基前,最好先确保碳酸氢钠充分溶解,避免局部pH偏高或偏低。再一个就是水的使用,一般配盐溶液,用三蒸水即可,而配制培养基务必用超纯水,并在使用前要高压灭菌。今天太晚了,先说到这,明天继续4、关于培养基的选用:我养过的细胞株不多,权当抛砖引玉吧。一般来说大部分细胞系我们都用高糖DMEM+10%FCS培养,我们实验室用该培养基的有:HepG-2、NIH-3T3、A549、Hela、C2C12、COS-7。特殊的,如P19Cl6用α-MEM+10%FCS,SGC-7901用RPMI-1640+10%FCS,293细胞则用MEM+热灭活的马血清。对于贴壁不是很紧的细胞,用45%DMEM+45%α-MEM+10%FCS有奇效~现附上前辈总结的帖子,希望对大家有帮助5、操作中的一些小细节:实验进行前,无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30分钟灭菌,以70%ethanol擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转数分钟后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转5分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。定期检测下列项目:CO2钢瓶之CO2压力、CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)、无菌操作台内之airflow压力,定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000小时/HEPA)、液氮罐中的液氮高度。水槽可添加饱和硫酸铜溶液,并定期换水。6、血清的相关问题:血清必须贮存于–20℃,若存放于4℃,不要超过一个月。如果一次无法用完一瓶,可将40~45ml分装于无菌50ml离心管中,预留此膨胀体积之空间,以免容器冻裂。一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。瓶装(500ml)血清一定要逐步解冻:4℃冰箱溶解一天,至室温下全溶后再分装,在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。热灭活是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须,一般不要作此热处理,因为会造成沉淀物之显著增多,且会影响血清之品质。以我们实验室做的对照试验看,未灭活血清效果的确要好些。细胞培养基的基本知识.doc(36.5k)good,很有帮助,谢谢7、贴壁细胞传代培养:一般步骤为:真空泵吸走培养基,1XPBS漂洗两次,加入1mlEDTA-Tripsin(100mm皿为例),37度放置数分钟,轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落,加入适量血清,以吸管上下吸放数次以打散细胞团块,离心后加入新鲜培养基,按比例转移至新皿。细胞的传代最重要的是胰酶处理时间,若胰酶处理太久,容易造成细胞贴壁不紧,显微镜下观察立体感不强,严重的时候甚至会造成细胞死亡。我谈谈个人经验:HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长,一般处理5-6min,C2C12、COS-7、NIH-3T3比较容易脱落,2min足矣,P19Cl6和293细胞贴壁不紧,可在PBS漂洗后,直接换新鲜培养基打散。8、细胞冻存及复苏:首先说冻存液配方,常用的配方一般是两种——90%FCS+10%DMSO或70%培养基+20%FCS+10%DMSO。前一种较贵,而且后一种冻存效果也不错,因此本人一般选用第二种配方。对于比较脆弱的细胞则选用前一种冻存液。冻存步骤比较简单,前期处理同细胞传代,只是在离心后是直接吸取上清,用手拍打离心管底部,加入适量冻存液使细胞完全悬浮后分装于冻存管。制后先将冻存管放入4℃冰箱,约40min。接着置于-20℃冰箱,约60min。置于-80超低温冰箱中放置过夜。最后置于液氮罐中长期保存。同时做好冻存记录,在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。注意事项:1使用DMSO前,不需要进行高压灭菌,它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构,以至于降低冷冻保护效果。2冻存时要选处于对数生长期的细胞,这样效果要好很多3不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度范围内过久,低温损伤主要发生在这一温度区内,是“危险温区”。4注意定期检查液氮罐内液氮量,及时添加。5冻存液中的培养基要与培养时相同,避免细胞由于环境突然改变而死亡,在冻存管上也要标明培养基种类。6冻存液不要预热。7程序冻存盒非常好用,省事省时效果还好,强烈推荐冻存使用冻存盒。细胞复苏的原则是快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。具体步骤:1.将水浴锅预热至40℃2.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。4.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。5.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。6.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。7.约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,8.平衡后,放入离心机中3000r/min离心3min9.吸弃上清液。10.向冻存管内加入1ml培养液,吹打制成细胞悬液。最后将细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内12-24小时后换液继续培养培养,换液的时间由细胞情况而定。注意事项:1复苏时选用的培养基要符合冻存管上标明的培养基。2操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。3自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉不好意思,写错了~好东西,谢谢你的辛勤劳动。真空泵中间接一个10000ml的大烧瓶啊~吸液的管子直接往烧瓶里漏,吸气的一头保证在液面以上就可以了那要看你用什么真空泵了.我们实验室用的水泵,不会大
本文标题:细胞培养的流程
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