实验一黄柏皮中小檗碱的提取

实验一黄柏皮中小檗碱的提取、分离与鉴定一、实验目的1掌握从黄柏皮中提取小檗碱的原理和方法。2掌握柱层析的基本操作方法以及其在中药有效成分提取分离过程中的应用。3掌握生物碱的鉴别方法。二、实验原理1、概述生物碱是植物中含氮的碱性有机化合物,大都有明显的生理活性,是许多中草药中的有效成分。它们是人类对植物研究得最早最多的一类有效成分,现已分离出有六千余种。这些生物碱在植物体内一般均与有机酸或无机酸结合成盐而存在,只有弱碱性生物碱往往呈游离状态,还有一些是与糖结合成苷而存在。小檗碱又名黄连素,是最先由毛莨科黄连（CoptischinensisFran）和芸香科黄柏(PhellodendronamurenseRup.)等植物中提出的一种黄色生物碱。黄连属植物的根茎、须根、叶中等都含有小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马亭等生物碱,我国黄连药材产量占世界第一位。现已发现，唐松草属（Thalictrum）、小檗科的小檗属(BerberisL.)、十大功劳属(MahomiaNuff)及防己科的天仙藤属（Fibraurea）等都可作为提取小檗碱的资源植物本实验是从黄柏皮中提取小檗碱。黄柏皮是豆科植物黄皮树（PhellodendronchinenseSchneid）或黄檗（P.amurenseRupr.）的树皮，其主要有效成分为小檗碱，小檗碱及其盐类有较好的抗菌作用，临床用以治疗菌痢和一般炎症。小檗碱是一种季铵碱,其游离碱为黄色针晶,Mp.145℃(乙醚),微溶于水,能溶于热水和乙醇中，难溶于苯、丙酮、氯仿，几乎不溶于石油醚。小檗碱与氯仿、丙酮、苯在碱性条件下均能形成加成物。不同小檗碱盐类在水中的溶解度均有较大差别。小檗碱盐酸盐难溶于冷水，易溶于热水；硫酸盐易溶于水。溶解度分别为:小檗碱,1∶２０（冷水）,1∶100(冷乙醇);盐酸盐,1∶500(冷水);硫酸盐,1∶30(冷水),利用这些特性提取盐酸小檗碱。小檗碱加热至110℃变为黄棕色，于160℃分解。盐酸小檗碱加热至220℃分解，生成红棕色的小檗红碱，因此干燥时温度不宜太高（一般不超过80℃）。小檗碱盐酸小檗碱NOOOCH3OCH3NOOOCH3OCH3Cl2、提取分离原理小檗碱属于季铵碱，其游离型在水中的溶解度最大。而其盐类以含氧酸盐在水中溶解度较大，不含氧酸盐难溶于水，其盐酸盐在水中溶解度则更小。利用此性质结合盐析法，可从黄柏皮中提取小檗碱。由于黄柏中含有大量的粘液质，故采用石灰乳法，使药材的粘液质与石灰乳生成难溶于水的钙盐，同时碱性条件下小檗碱游离出溶于水层，加盐酸使其转变为盐酸盐，降低其在水中的溶解度，再结合盐析法，使小檗碱以沉淀析出。三、仪器与试剂1.仪器：渗漉柱、层析柱、烧杯、布氏漏斗、抽滤瓶、蒸发皿、滤纸、锥形瓶、螺旋夹等2.试剂与样品：黄柏皮粉、石灰乳、蒸馏水、食盐、10%盐酸、浓盐酸、95%乙醇、中性氧化铝（100-200目）、脱脂棉、漂白粉水溶液、碘化铋钾试剂、碘化汞钾试剂、碘化碘钾试剂、硅乌酸试剂。四、实验内容及流程（一）小檗碱的提取称取黄柏皮粗粉200g，加入150ml石灰乳拌湿，溶胀30min后加入8倍量水浸渍90min后渗漉。渗漉液加入总体积20%的食盐（缓慢加入），部分未溶解NaCl用玻棒缓缓搅拌，静置30min，抽滤，得小檗碱粗品。（二）小檗碱的精制将所有粗品（湿品）称重，放入烧杯中，加20倍量蒸馏水，加热至沸，趁热抽滤，略放冷后向滤液中滴加浓盐酸，调pH到2，放置2h，过滤，滤出的沉淀用少量蒸馏水洗至pH值为5，抽干，80℃以下干燥，称重，得精制盐酸小檗碱。（三）柱层析演示实验（四）检识1．生物碱的一般鉴定反应去少量精制盐酸小檗碱，用酸水溶解，分成四份，分别滴加试剂（1）碘化铋钾试剂，观察产生沉淀颜色；（2）碘化碘钾试剂，观察产生沉淀颜色；（3）硅乌酸试剂，观察产生沉淀颜色或溶液浑浊情况。记录观察到的现象和反应结果以及得出结论。2、小檗碱的特殊鉴别反应取盐酸小檗碱少许，加稀盐酸2ml溶解后，加漂白粉液3滴，即产生樱红色。实训思考1．从黄柏皮中提取小檗碱是利用了它的什么性质？2．提取分离过程中加NaCl起什么作用？黄柏皮粗粉（200g）加入150ml石灰乳拌湿，溶胀30min后再加入8倍量水浸渍80min后渗漉渗漉液药渣（弃去）加入总体积20%的食盐静置抽滤滤液沉淀（小檗碱粗品）溶于20倍量沸水，趁热抽滤不溶物滤液滤液加浓盐酸调pH2左右，放置，抽滤沉淀用蒸馏水洗至中性，80℃下烘干盐酸小檗碱实验二虎杖中蒽醌类成分的提取分离与鉴定【实验目的】1．了解苷和苷元的提取分离方法2．掌握pH梯度萃取法在分离重要有效成分中的应用，并能通过被分离化合物的结构分析实验结果3．掌握蒽醌类化合物的鉴定方法【实验原理】1、概述虎杖为蓼科植物虎杖（PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.）的干燥根茎和根。具有祛风利湿，散瘀定痛，止咳化痰的功效。虎杖中的成分主要含蒽醌的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等游离蒽醌，大黄素-6-甲醚-8-O-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-D-葡萄糖苷等。尚含非蒽醌成分，主要是白藜芦醇葡萄糖苷，又称虎杖苷、云杉新苷，用于防止细胞癌变和恶性肿瘤的扩散，对艾氏腹水瘤有抑制作用。白藜芦醇还具有扩张血管降压、抗血栓形成、降血脂等方面的作用。此外还有鞣质等成分。1）．大黄素（emodin）本品系橙黄色长针晶（乙醇），溶点256～257℃，几乎不溶于水，易溶于乙醇及碱液(NH4OH，Na2CO3，NaOH水溶液)。2）．大黄酚（chrysophanol）本品为六角形片状结晶，或针状结晶，熔点196℃，能升华，不溶于水，溶于苯、三氯甲烷、乙醚、冰醋酸，难溶于石油醚，可溶于NaOH水溶液及热的Na2CO3水溶液。3）．大黄素-6-甲醚（phyclone）本品为黄色针状结晶，熔点207℃，能升华不溶于水，溶于苯、三氯甲烷、乙醚、乙醇、冰醋酸，难溶于石油醚，易溶于NaOH溶液。OOOHH3COHR1R1=OH大黄素=H大黄酚=OCH3大黄素甲醚4）．白藜芦醇（resveratrol）本品又称菧三酚，为无色片状结晶或针晶，熔点256～257℃，能升华，易溶于乙醚、三氯甲烷、丙酮、乙醇、甲醇等。5）．白藜芦醇苷（polydatinpeceid）又称菧三酚苷，为无色针状簇晶，含一分子结晶水者在138～140℃熔融，继续加热又固化，至225～226℃全融。难溶于乙醚，可溶于醋酸乙酯，易溶于丙酮、乙醇、甲醇、热水和Na2CO3、NaOH水溶液。白藜芦醇葡萄糖苷（polydatin）2、提取分离原理根据虎杖中游离蒽醌和苷类均可溶于乙醇而提取，因苷和苷元在水和乙醇中的溶解度不同采取萃取方法，以石油醚分离出极性小的苷元游离蒽醌，以水分离出极性大的苷类成分，再进一步用pH梯度萃取法使酸性强弱不同的游离蒽醌得以分离。【实验材料】烧杯、渗漉柱、水浴锅、铁架台、分液漏斗、锥形瓶、表面皿、试管、层析缸、量筒、抽滤瓶、布氏漏斗、pH试纸、橡皮管、螺旋夹、载玻片、显微镜、石棉网、酒精灯、镊子、棉花、滤纸虎杖粗粉、95%乙醇、石油醚、5%NaHCO3溶液、20%盐酸、5%Na2CO3溶液、2%NaOH溶液、30%H2O2溶液、氨水、薄层硅胶G、CMC-Na、蒸馏水、甲醇、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、环己烷、0.5%醋酸镁乙醇溶液【实验步骤】一、提取分离工艺流程（一）蒽醌的提取与分离（二）白藜芦醇葡萄糖苷1）95%乙醇拌湿，装柱2）95%乙醇（200ml）浸泡过夜3）渗漉渗漉液减压回收乙醇（至70ml左右）乙醇总提物沉淀部分滤液石油醚（100ml+50ml*2)萃取水层（留用）（苷）石油醚层5%NaHCO3(50ml*3)石油醚层NaHCO3层5%Na2CO3（40ml*3）石油醚层Na2CO3层1)20%HCl，调pH1-22）抽滤大黄素（1）1)20%HCl，调pH1-22）抽滤、水洗、干燥3）95%乙醇重结晶沉淀母液水洗至中性，干燥称重强酸性成分2%NaOH(50ml*3）石油醚层NaOH层1)20%HCl，调pH1-22）抽滤、水洗、干燥大黄酚+大黄素甲醚混合物（2）抽滤（上层）（下层）（下层）（上层）（下层）（上层）虎杖根茎粗粉(200g)水层（含白藜芦醇苷）1）挥去乙醚，加水（200ml+100ml*2），加热煮沸，搅拌15min2）倾去上清液上清液冷却、过滤，加活性炭2g煮沸15min，趁热过滤滤液水浴浓缩至30ml，冷却加乙醚5-10ml，置冰箱析晶，过滤粗晶30%甲醇甲醇热溶，活性炭脱色过滤、浓缩、放置析晶，滤过白色晶体（含白藜芦醇苷）（3）二、鉴定1、游离蒽醌类化合物的一般鉴别反应将上述分离得到（1）（2）各少许，加95%乙醇使溶解，分别做下列试验，观察颜色变化。（1）Bornträger’s反应取上述样品溶液分别加数滴2-3滴2%NaOH水溶液，观察颜色变化，再加少量30%H2O2液，加热后观察颜色，然后加酸至酸性时，再碱化，观察反应过程中颜色变化（凡具有邻位或对位羟基的蒽醌类化合物加碱液后呈紫兰色；其他羟基蒽醌呈红色）。（2）醋酸镁试验上述样品溶液分别加0.5%醋酸镁乙醇溶液数滴，观察颜色变化（几乎有邻位或对位羟基的蒽醌呈红紫色→兰色，有二个2-羟基的或与之互成间位羟基的蒽醌呈橙红→红色，只有一个α-羟基或一个β-羟基或二个羟基互为间位羟基的蒽醌呈黄橙→橙色）。（3）升华实验取虎杖粉末少许，平铺于载玻片中部后放在垫有石棉网的小铁圈上，玻片两端各放一小棍，再盖上另一载玻片，其上置一块润湿棉花（注意上面的玻片勿触及粉末）。用酒精灯小心隔石棉网加热检品，边加热边移动酒精灯，以免过热烧焦检品。当上面玻片上凝结有明显升华物时，停止加热。冷却后，取下盖片，置于显微镜下观察，多数为黄色针晶或羽毛状晶体，加碱液呈红色反应。2、虎杖苷的鉴别（1）三氯化铁反应样品（3）数毫克，溶于0.5ml乙醇中，滴加1%FeCl3溶液数滴，观察颜色变化（有酚羟基者常呈黄、绿、紫、红等色）。（2）香草醛反应取样品数毫克，加乙醇，1ml溶解后，加香草醛盐酸试剂，凡有间苯二酚或间苯三酚结构者呈红色。（3）重氮盐反应去样品数毫克，加5%Na2CO3溶液0.5ml，滴加新配置的重氮盐试剂1-2滴，凡酚羟基邻位或对位无取代者呈红色。3、薄层鉴定（1）制版称取2g层析用硅胶G于小乳缸中，加5-7ml5‰CMC-Na水溶液研磨成糊状，待气泡除尽后均匀地铺于洁净干燥玻片上，用手晃动或者振动玻片，使糊状物流布于整块板面上，使其表面光滑平整。然后将玻板放平，室温晾干后于110℃加热活化30min，取出，待温度降低后置于干燥器中备用。（2）点样分别取少量样品（1）（2）于小试管中，用丙酮溶解，毛细管吸样品，轻轻点在制好的薄层板上。点样的原点直径不得超过3mm，几个样品需要在距离玻板边缘1cm左右的同一起始线上，有一定的间隔。（3）展开预先将展开剂（环己烷：乙酸乙酯（7:3））倒入洗净烘干的层析缸的一侧（注意液面不要超过中间的隔槽），然后将已点样的薄层板放入槽内未加展开剂的一侧，盖好玻板饱和5-10min，倾斜层析缸，将展开剂转入放有薄层板的一侧，使薄板浸入溶剂进行展开，展开式薄层板上的样品不能浸入溶剂中，展距在7-8cm时，取出，迅速记下前沿位置。（4）显色①先在可见光下观察，记录有色斑点出现的位置②用浓氨水熏或喷以2%氨水后观察斑点的色泽变化，再在紫外光下观察荧光斑点的变化。（5）计算Rf值Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离【实验说明】1．乙醇总提取物的制备称取虎杖根茎粗粉200克，加95%乙醇拌湿均匀装于渗漉筒中，边装边用木槌压紧，整平，使筒内药材均一直，装筒后表面上盖一圆形滤纸，滤纸上面用几块小石压上，加200ml95%乙醇于渗漉筒中，浸泡过夜，次日打开螺旋夹，收集渗漉液，将渗漉液装入圆底烧瓶中回收乙醇至100ml左右，得乙醇总提物。2．总游离蒽醌的提取将乙醇总提取物抽滤，滤液置于500ml分液漏斗中，加乙醚200ml萃取，充分振荡后放置，倾出上层醚层，下层残留液再加100ml石油醚萃取两次