实验七薄层色谱和天然色素的提取

实验五薄层色谱和天然色素的提取（7学时）一、实验目的1．了解薄层色谱的一般原理和意义，学习薄层色谱的操作方法。2．掌握液体有机化合物的干燥。3．掌握天然色素的提取方法。二、实验原理绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。其结构如下：叶绿素中a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子含有一个极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。胡萝卜素是具有长链结构的共轭多烯，它有三种异构体，即α或-、β-和γ-异构体，其中β-异构体含量最多，也最重要。生长期较长的绿色植物中，异构体β-体的含量多达90%。β-体具有维生素A的生理活性，其结构是两分子维生素A在链端失去两分子水结合而成的。在生物体内，β-体受酶催化即形成维生素A。目前β-体已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。叶黄素是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。故本实验采用甲醇——石油醚的混合溶剂提取以上三种色素。薄层色谱又称为薄层层析,属于固-液吸附色谱。其基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。当流动相（展开剂）带着混合物组分以不同的速率沿板移动，即组分被吸附剂不断地吸附，又被流动相不断地溶解——解吸而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相也有不同的解吸能力。因此，在流动相向前移动的过程中，不同的组分移动不同的距离而形成了互相分离的斑点。在给定条件下（吸附剂、展开剂的选择，薄层厚度及均匀度等），化合物移动的距离与展开剂前沿移动的距离之比值（Rf值）是给定化合物特有的常数。即：沿的距离样品原点中心到溶剂前心的距离样品原点中心到斑点中Rf影响Rf值的因素很多，如样品的结构、吸附剂和展开剂的性质、温度以及薄层板的质量等。当这些条件都固定时，化合物的比移值Rf是一个特性常数。但由于实验条件容易改变而不易固定，因此在鉴定一个具体化合物时，经常采用与已知标准样品对照的方法。利用薄层色谱进行分离及鉴定工作，在灵敏、快连、准确方面比纸色谱优越。薄层色谱的特点是：（1）设备简单，操作容易；（2）分离时间短，只需数分钟到几小时即可得到结果，因而常用来跟踪有机反应监测有机反应完成的程度；（3）分离能小虽，斑点集中，特别适用于挥发性小，或在高温下易发生变化而不能用气相色谱分离的物质；（4）可采用腐蚀性的显色剂如浓硫酸，且可在较高温度下显色；（5）不仅适用于小量样品（几毫克）的分离，也适用于较大量样品的精制（可达500毫克）。应该指出，薄层色谱是否成功，与样品、使用的吸附剂、展开剂以及薄层的厚度等因素有关。三、试剂及器材1．器材：剪刀、研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸、玻棒、洒精灯、石棉网、载玻片(2.5cm×7.5cm，6块)。2．试剂：硅胶G，羧甲基纤维素钠、中性氧化铝(150～160目)、甲醇、95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、菠菜叶。四、主要试剂及产品的物理常数名称分子量性状折光率比重熔点℃沸点℃溶解度：克/100ml溶剂水醇醚乙醇46.07liq1.36000.7893-14478∞∞∞丙酮58.07liq1.35880.7899-9456.2∞∞∞未完，请自己查五、实验内容与基本操作1．薄层色谱（1）吸附剂与展开剂：吸附剂（固定相）：用于与样品发生吸附作用的固定不动的物质。在混合物样品流经吸附剂（固定相）的过程中，由于各组分与吸附剂（固定相）吸附力的不同，就产生了速度的差异，从而将混合物中的各组分分开。一般常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。硅胶可分为硅胶H（不含黏合剂）、硅胶G（含黏合剂）和硅胶HF（含荧光物质，可在紫外光下观察）等。氧化铝同样也可分为以上几种类型。展开剂（流动相）：也称洗脱剂，在色谱过程中起到将吸附在固定相上的样品洗脱的作用。选择展开剂时应考虑样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素。展开剂的极性越大，对化合物的解吸附（洗脱）能力就越大，即Rf值就越大。如选用一种溶剂（展开剂）后发现其样品成分的Rf值都比较大，则可换用一种极性较小的展开剂，也可在原展开剂中加入一种极性较小的溶剂。展开剂的洗脱能力按下列次序递增：已烷，四氯化碳，甲苯，苯，二氯甲烷，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，丙酮，丙醇，乙醇，甲醇，水。（2）薄层色谱的操作步骤薄层色谱是通过制浆、涂片、点样、展开及显色来完成的。①制浆浆液的制备可分为干法和湿法。干法是将选好的硅胶G慢慢倒入溶剂中调成糊状备用。湿法是将水和硅胶G按1：4的比例在搅拌下将硅胶G慢慢地倒入水中调成糊状，不要反过来加，防止形成团块。湿法制浆要在使用前调制，否则浆料容易凝固结块。②涂片大量使用可用涂布器涂布。简单的涂布方法是将两片载玻片用肥皂水和水洗涤干净，再用碎滤纸吸干玻片上的水分，然后将其重叠在一起，用手夹住片的上端，慢慢浸入已调好的浆液浸涂2s左右（上端留一些不浸涂），然后缓慢地将载玻片从浆液中取出，要求版面均匀平滑，载片边缘上的浆料用抹布轻轻地擦去，小心将两片分开，放在磁盘中。待浆料自然干燥后放入烘箱，在105～110℃下活化，约30min就制成了薄层板，取出来进行点样。③点样在活化好的薄层板下约1cm处的边上轻轻地用铅笔点一个标记作为起始线。用一根内径约一毫米的毛细管吸取制备好的试样。吸取的试样不要太多，防止样点扩散。在起始线的中央轻轻地接触薄层板，点样要迅速，接触即刻移开。待样点溶剂挥发后再重复点样约3～4次。样点直径不要超过2mm，太大会出现拖尾现象。如果在一块薄层板上点两个以上的样点要分开距离。样点点好后就可以展开。④展开将展开剂倒入展开瓶或合适的广口瓶中，使液面在样点的下方，不要接触到样点，否则样点会被溶入展开剂中无法进行展开。将薄层板小心斜放在展开瓶中盖好盖，观察展开剂通过毛细管作用沿板上行。此时溶剂上行很快，必须留心观察。当展开剂上行至距离涂层顶端约5mm时，将板小心取出，用铅笔做好溶剂前沿的位置记号。样点各组分随展开剂上行同时被展开在各个部位而形成各个有色斑点，取斑点的中心位置做好记号。如果斑点没有颜色就用显色法使斑点显示出来。一种是在色谱缸中或密闭的容器中放入几粒碘，把展开后的薄层板放入，待斑点明显时取出做好记号。另一种是带有荧光的硅胶可用紫外灯照射观察斑点。2．菠菜叶色素的提取与分离（1）菠菜色素的提取将菠菜叶洗净，甩去叶面上的水珠，摊在通风橱中抽风干燥至叶面无水迹。称取20g，用剪刀剪碎，置于研钵中，加入20mL甲醇，研磨5分钟，转入布氏漏斗中抽滤，保留滤液。将布氏漏斗中的糊状物放回研钵，加入体积比为3:2的石油醚一甲醇混合液20mL，研磨，抽滤。用另一份20mL混合液重复操作，抽干。合并两次的滤液，转入分液漏斗，每次用10mL水洗涤两次，弃去水一醇层，将石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入蒸馏瓶中，水浴加热蒸馏至剩约1mL残液。（2）薄层层析铺制羧甲基纤维素钠硅胶板6块，点样，用体积比为8:2的石油醚-丙酮混合液作展开剂，展开后计算各样点的Rf值，观察各色带样点是否单一，以认定柱中分离是否完全。建议按下表次序点样。薄板序号一二三四五六样点序号12345678910备补点样物质原提取液原提取液原提取液第一色带原提取液第二色带原提取液第三色带原提取液第四色带各样点的Rf值因薄层厚度及活化程度不同而略有差异。大致次序为，第一色带β-胡萝卜素(橙黄色，Rf≈0.75)；第二色带叶黄素(黄色，Rf≈0.7)[3]；第三色带叶绿素a(蓝绿色，Rf≈0.67)；第四色带叶绿素b(黄绿色，Rf≈0.50)。在原提取液(浓缩)的薄层板上还可以看到另一个未知色素的斑点(Rf≈0.20)。六、注意事项七、成功关键八、思考题1．试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在薄层板上移动最快？2．如何利用Rf值来鉴定化合物？3．展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么影响？