实验三细胞外周血DNA的提取

实验三、外周血细胞基因组DNA的提取(NaI法)基因组DNA提取原理Loparev等报道利用NaI提取DNA的方法，从全血制备白细胞DNA，可用双蒸水溶涨红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核。加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全（异戊醇去泡沫），DNA存在于上层水相中，以异丙醇沉淀DNA，离心弃去异丙醇，并重复操作一次，即可获得白细胞DNA。•氯仿/异戊醇：使蛋白变性。氯仿的作用是蛋白变性剂、抽提脂溶性物质;异戊醇作用是A.降低表面张力、阻止气泡的产生(剧烈震荡时容易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用);B.有助于分相(使离心后水相、有机相稳定)•异丙醇：沉淀DNA•70%乙醇：洗涤DNA;(盐、蛋白等溶于70%乙醇，而DNA不溶)•100%乙醇：可以用于沉淀DNA，也可以用于使DNA快速干燥限制性核酸内切酶作用原理限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并对其进行切割的核酸内切酶。PCR反应原理基于DNA的半保留复制，两条链都可以作为模板。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。PCR反应反复进行三步骤的循环过程：热变性——退火——引物延伸1）热变性：基因组DNA在95℃下加热5分，双螺旋结构被热变性解链为两股单链。2）退火：将反应混合物降温至55~65℃，引物与上述单链DNA上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板——引物复合。3）引物延伸：将反应混合物调节至72℃，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，从引物3’端开始，沿着5’—3’的方向，按照模板链的序列，合成一条新DNA链，其序列与模板序列互补。器具和试剂•离心机、振荡器、Eppendorf管，移液器等•抗凝人外周血，双蒸水，6MNaI溶液，氯仿/异戊醇，70％乙醇，TE溶液试剂•抗凝人外周血，双蒸水，6MNaI溶液，氯仿/异戊醇，70％乙醇，TE溶液步骤1．取外周抗凝血（全血）200ul于Eppendorf管中，12000rpm离心12min。2.弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。混匀后加6MNaI溶液200ul，充分摇匀20s。3.加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。步骤4.取上层液350ul，加入另一新Eppendorf管中，加210ul异丙醇，重新摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴Eppendorf管壁。5.弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动，可轻轻颠倒混匀），以15000rpm离心12min。步骤6.弃乙醇，敞开Eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA。（制成的DNA液置于-20℃冰箱保存备用）7．用DNA／RNACalculator检测DNA的含量和纯度。纯DNA的此比值约为1.8～2.0。纯RNA的比值约为大于2.0。步骤8、限制性内切酶酶切：下述各试剂加入Eppendorf管内：a、涡旋混匀，短暂离心。b、置恒温水浴箱内，按EcoRI限制酶的活性温度要求，37℃酶解过夜C、置于4℃或-20℃保存。人类基因组DNA0.1-1ug10×酶解缓冲液2ulEcoRI（10u/uL）1ul加双蒸水至20ul(建议先算好体积，最先加)步骤9、聚合酶链式反应：a、25ul标准PCR反应体系各成分终浓度如下：b、标准PCR反应循环参数：95℃：5min预变性；94℃30s63℃30s、72℃60s，共30个循环；72℃7min。c、置于4℃或-20℃保存。模板DNA50～100ngTaqDNA聚合酶0.5～1uL上游引物(10uM)1uL下游引物(10uM)1uL10×DNA聚合酶缓冲液2.5uL加双蒸水至25ul(建议先算好体积，最先加)