实验二土壤中放线菌的分离

实验二土壤中放线菌的分离实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。实验材料：药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。实验步骤：1.高氏一号合成培养基的制备高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4•3H2O0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，FeSO4•7H2O0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。2.土壤中放线菌的分离（1）待测样液的制备选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。（2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌取2支1毫升移液管分别从10-5、10-4菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-5、10-4的培养皿内。将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（3）涂布平板法分离土壤中放线菌取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-4、10-5）、组别、姓名、操作日期等。每个稀释度做一个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。用无菌吸管从浓度最小稀释液开始，每次吸取0.1ml加到一组相应编号（10-5）的高氏一号平板上（每次吸取前，吸管要在液体内吹吸几次），再依次将10-4的土壤稀释液加到相应平板上。用无菌刮棒（从浓度小的稀释液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。（4）平板划线法分离土壤中放线菌取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。每组两个平板培养基。将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许10-2浓度的土壤稀释液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。（5）培养接种完毕，将平皿放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。（6）挑菌落待三种方法的平板长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。转种至斜面，菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保存。准备实验内容：问曾老师借无菌刮棒打火机酒精灯无菌报纸包（1个）99mL水/三角瓶（玻璃珠）5支移液管3支9mL水的试管培养皿6套枪头（1mL/0.1mL）高氏一号培养基500mL（150mL三角瓶2个，200mL试管）思考题：1.检查接种后培养物的生长情况和染菌情况。2.观察与记录以下内容。大小形状边缘颜色表面代谢物种类3.如何区分放线菌和真菌、细菌？放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。霉菌菌落的话应该是比较大的，可能是大而疏松也可能大而紧密，其他一些跟放线菌都差不多，比如都是颜色多种多样，与培养基紧密结合难于挑取。但在气味上有很大差别，放线菌具有泥腥味，而霉菌具有霉味。还有一点就是放线菌菌落周围琼脂平面会有变形的现象。若稀释平板的稀释度不够，放线菌会被抑制了或者菌落太小，而其他细菌的菌落又太多，不容易找到。