实验五影响酶活力的因素

实验10影响酶活力的因素——正交实验法（碘量法测定酶活力）四个班，每班分16组两个同学一组目的要求：初步掌握正交实验设计法（简称正交法）的使用，运用正交法测定底物浓度、温度和pH这三种因素对酶活力的影响。实验原理：酶反应受到多种因素的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂等都能影响酶的反应速度。这种多因素的实验可通过正交法即用—特制的表格——正交表来安排试验，计算和分析实验结果。这样就能通过少量实验取得较好的效果。实践证明正交法是一个多、好、快、省的方法，目前已广泛用于农业生产和科学实验中。本实验运用正交法测定酶浓度、温度、PH值这三个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、温度和pH值时酶的活性最大。酶活力用硫代硫酸钠滴定法测定。过氧化氢酶能把过氧化氢分解成水和氧，其活力大小以一定时间内一定量的酶所分解的过氧化氢量来表示。被分解的过氧化氢量可用碘量法间接测定。当酶促反应进行一定时间后，终止反应，然后以钼酸铵做催化剂，使未被分解的过氧化氢与碘化钾反应放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘。其反应为：H2O2+2KI+H2SO4→I2+K2SO4+2H2OI2+Na2S2O4→2NaI+Na2S4O6反应完后，以样品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的过氧化氢量，即可计算出酶的活力。实验器材：试管15毫升试管9*16=144支吸管1毫升2*16=32支吸管5毫升2*16=32支吸耳球16个漏斗1个研钵（或者搅碎机）1个（1台）恒温水浴锅3台铁架台16个蝴蝶夹16个酸碱两用滴定管16个100毫升的三角烧瓶3*16=48个烧杯500毫升18个（装好水放到恒温水浴锅里）实验所需药品：1.0.01mol/L的过氧化氢溶液每组消耗50毫升，每班需16ⅹ50=800毫升1.1毫升过氧化氢溶液，用蒸馏水定容至1000毫升。（用带盖白色试剂瓶分装10瓶。分装1000毫升即可，其余3000用白色大试剂瓶装好备用）2.1.8mol/L的硫酸溶液（每组消耗50毫升，每班需16ⅹ50=800毫升）共配4000毫升95毫升浓硫酸，用蒸馏水定容至1000毫升。（用带塞白色试剂瓶分装10瓶。分装1000毫升即可，其余备用）3.10%钼酸铵溶液(每组需30滴，每班需16ⅹ30=480滴)共配500毫升20克钼酸铵，少量蒸馏水溶解，用蒸馏水定容至200毫升（用带胶头滴管的白色试剂瓶分装10瓶。）4.0.02mol/L硫代硫酸钠溶液（每组消耗50毫升，每班需16ⅹ50=800毫升，配置6000毫升）4.97克硫代硫酸钠溶解于少量蒸馏水，蒸馏水定容至1000毫升。（用带胶头滴管的白色150毫升试剂瓶分装10瓶，分装1000毫升即可，其余备用）5.1%的淀粉溶液（每组需50滴，每班共需16ⅹ50=800滴，每班需200毫升，实验临用前配置）2克淀粉，加入50毫升开水完全溶解，后用蒸馏水定容至200毫升。（用带胶头滴管的白色试剂瓶分装6瓶）6.20%的碘化钾溶液（每组需12毫升，每班共需16ⅹ12=192毫升）共配1000毫升200克碘化钾溶解于少量蒸馏水中，蒸馏水定容至1000毫升。（用棕色容量瓶配，用带塞棕色50毫升试剂瓶分装，分装10瓶）7.巴比妥钠---盐酸缓冲液A液：0.04mol/L巴比妥钠盐8.25克蒸馏水溶解，再用蒸馏水定容至1000毫升B液：0.2mol/L16.5毫升浓盐酸加蒸馏水定容至1000毫升pH5巴比妥钠--盐酸缓冲液：用洁净烧杯配制A液1000毫升+B液200毫升（用pH计测，用盐酸和氢氧化钠调pH）pH7巴比妥钠---盐酸缓冲液：用洁净烧杯配制A液1000毫升+B液178毫升（用pH计测，用盐酸和氢氧化钠调pH）pH9巴比妥钠---盐酸缓冲液：用洁净烧杯配制A液1000毫升+B液165毫升（用pH计测，用盐酸和氢氧化钠调pH）实验步骤：1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片1.25克，剪碎置研钵中，加入约0.5克碳酸钙和10毫升水研磨成匀浆，用漏斗移入250毫升容量瓶中，研钵少量蒸馏水冲洗，洗液也移入瓶中，用蒸馏水定容至刻度。（由加班同学在每次课前准备，用带塞白色50毫升试剂瓶分装10瓶，每瓶大约分25毫升。标签名称：酶液）2.实验设计本实验取三个因素，酶浓度[E]、温度、pH值。每个因素选三个水平（水平即允许因素允许变化范围内，要进行试验的“点”，见下表：表1正交试验设计表酶浓度/[E]ml温度/℃pH10.537521.550732.5609按一般方法,如对三个因素三个水平的各种搭配都要考虑,共需做33=27此实验，而用正交表只需做9次试验.选用L9表(L是正交表的代号),L右下角的数字表示试验次数)。因素水平表2L9表1（酶浓度/[E]ml）2（温度/℃）3（pH）11(0.5)1（37℃）1（5）21(0.5)2（50℃）2（7）31(0.5)3（60℃）3（9）42(1.5)1（37℃）2（7）52(1.5)2（50℃）3（9）62(1.5)3（60℃）1（5）73(2.5)1（37℃）3（9）83(2.5)2（50℃）1（5）93(2.5)3（60℃）2（7）L9表有两个特性：（1）.每一列中“1”“2”“3”这三个数字都出现三次，即出现次数相同。（2）每两列的横行组成的“数对”共有九个，九种不同的数对（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3、3）各出现一次。在每一列中各个不同的数字出现的次数相同；每两列的横行组成的各种不同的“数对”出现的次数也都相同，这两点就是正交表的特点，它保证了用正交表安排的试验计划的均衡搭配的。因此，分析数据比较方便，结果比较可靠。2.实验安排将本实验的四个因素依次放在L9的第1、2、3列，再将各列的水平数用该列因素相应水平写出来，就得到下面的实验安排表。正交法测定集中因素对酶活力的影响——实验安排表1472583690.01mol/LH2O2/ml5巴比妥钠-盐酸缓冲液/mlpH59.5pH78.5pH97.5pH79.5pH98.5pH57.5pH99.5pH58.5pH77.537oC预温5min50oC预温5min60oC预温5min酶液/ml0.51.52.50.51.52.50.51.52.537oC反应10min50oC反应10min60oC反应10min1.8mol/L的硫酸/ml5毫升终止反应表中试验号共9个，表示要做9次试验，每次试验的条件如每一纵行所示。如做第一试剂/ml试验号列号试验号试验时0.01mol/LH2O25ml，[E]是0.5ml，温度37oC，pH为5，其余类推。另取第10支试管，作非酶对照，即加0.01mol/LH2O25ml，缓冲液7.5毫升，1.8mol/L的硫酸5ml，摇匀放置10分钟后加入酶液2.5ml。各反应管及对照管倒入三角烧瓶，各瓶分别加入20%的碘化钾溶液1ml和3滴钼酸铵溶液，然后依次用0.02mol/L的硫代硫酸钠滴定，滴定至溶液呈淡黄色后加入5滴淀粉溶液，再继续滴定至蓝色消失即到终点，记下各瓶消耗的硫代硫酸钠的体积。计算酶活力（1）按国际酶活力单位计算被分解的过氧化氢量（微摩尔）=1/2ⅹV(硫代硫酸钠空白滴定值-样品滴定值)（ml）ⅹ0.02ⅹ103过氧化氢酶活力（IU）=（被分解的过氧化氢量（微摩尔）ⅹ50）/(时间ⅹ样品重量（g）)(2)按习惯酶活力单位计算被分解的过氧化氢量（mg）=V(硫代硫酸钠空白滴定值-样品滴定值)（ml）ⅹ0.02ⅹ1/2ⅹ34.02过氧化氢酶活力（IU）=（被分解的过氧化氢量（mg）ⅹ50）/(时间ⅹ样品重量（g）)3.实验记录及分析实验做好后，把9个数据填入下表试验结果栏内，按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水平试验结果总和，再取平均值（各自被3除）。最后计算极差。极差是指这一列中最好和最坏的之差，从极差的大小可以看出哪个因素对酶活力影响最大，哪个最小。找出在何种条件下酶活力最高，最后做一直观分析结论。正交法测定几种因素对酶活力的影响——数据记录及分析1（酶浓度/[E]ml）2（温度/℃）3（pH）实验结果过氧化氢酶活力IU11(0.5)1（37℃）1（5）21(0.5)2（50℃）2（7）31(0.5)3（60℃）3（9）42(1.5)1（37℃）2（7）52(1.5)2（50℃）3（9）62(1.5)3（60℃）1（5）73(2.5)1（37℃）3（9）83(2.5)2（50℃）1（5）93(2.5)3（60℃）2（7）Ⅰ（一水平试验结果总和）Ⅱ（二水平试验结果总和）Ⅲ（三水平试验结果总和）Ⅰ/3Ⅱ/3列号试验号Ⅲ/3极差以酶活力值（Ⅰ/3，Ⅱ/3，Ⅲ/3）为纵坐标，因素的水平数为横坐标作图。