实验六PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测-教案

授课教师常祖明学生人数55课题PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测授课类型新授课授课方法讲授、演示教学用具多媒体、实验室设备教学目的通过本实验掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学会琼脂糖凝胶电泳的操作技术教学重点琼脂糖凝胶的制备及点样操作教学难点理解琼脂糖凝胶电泳的原理教学过程一、实验目的1.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理2.学会琼脂糖凝胶的制作和进行电泳的方法二、实验原理1.DNA琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖是一种线性多糖聚合物，天然聚合长链状分子，在沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小取决于琼脂糖的浓度，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。（1）电荷效应DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电泳时向阳极移动。【等电点】在某一pH的溶液中，DNA分子解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH称为该DNA分子的等电点，用pI表示。当DNA溶液pH＞pI，-当DNA溶液pH＜pI，+当DNA溶液pH=pI。溶解度最小。（2）分子筛效益在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度主要取决于分子筛效益，即DNA分子本身的大小和构象（共价闭环DNA线状DNA开环DNA），而且其迁移速度与其相对分子质量的对数值成反比，所以不同相对分子质量的DNA分子可以在琼脂糖凝胶电泳中分离。2.溴化乙锭对DNA分子进行染色的原理观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA分子。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入到DNA分子中的碱基对之间形成络合物，这种络合物在紫外光下发射的荧光要比单纯的DNA分子要强的多，便于DNA的检测。三、实验器材1.电泳仪北京市六一仪器厂，DYCZ-24DN型2.移液枪：5µl3.微波炉4.锥形瓶：250ml5.线手套6.容量瓶：1000ml7.紫外分析仪四、实验材料与药品实验材料：实验五中鸡血DNAPCR产物1.DNAMarker作用：主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。通过其大小可以粗略估算样品DNA分子量的大小。商品信息：2000bp，50次，紫色液体理化性质：DNAMarker是分子量不同的DNA片段，主要成分Tris-HCl、EDTA、甘油、溴酚蓝储存：短期4℃保存，长期-20℃保存。危害：避免与皮肤眼睛接触。2.GoldView核酸染色剂作用：一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µlGoldView™即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。商品信息：1ml/瓶理化性质：储存：室温保存2年。危害：虽然未发现GoldView有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。【使用方法】1.将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%~2%）在微波炉中融化。2.加入5µlGoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡。3.冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。4.电泳完毕在紫外灯下观察。【注意事项】1.胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。2.加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。3.琼脂糖作用：制备琼脂糖凝胶原料，分离和鉴定核酸。商品信息：100g/瓶理化性质：琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。储存：阴凉干燥处密闭储存。危害：无4.三羟甲基氨基甲烷（Tris）作用：生物缓冲剂，用于凝胶电泳配置缓冲液。商品信息：500g/瓶理化性质：是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。储存：有吸湿性，在阴凉干燥处密闭储存。危害：对眼睛、皮肤、呼吸道有刺激作用。5.硼酸作用：TBE缓冲液成分之一。商品信息：分析纯，500g/瓶理化性质：为白色粉末状结晶或三斜轴面鳞片状光泽结晶，有滑腻手感，无臭味。溶于水、酒精、甘油、醚类及香精油中，水溶液呈弱酸性。储存：阴凉干燥处密闭储存。危害：有刺激性。6.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）作用：螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。商品信息：瓶/250g。理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。7.6×DNALodingBuffer作用：第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰FF起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TBE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。商品信息：5ml/瓶。含溴酚兰、二甲苯青和甘油等，按5ul样品加1ulBuffer，混匀直接上样。理化性质：储存：2-8℃两年。危害：有刺激性。五、实验试剂1.0.5×TBE（PH8.0）缓冲液【5×TBE缓冲液（PH8.0）】母液{Tris108g+硼酸27.5g+0.5MEDTA20ml}定容到1000ml高压灭菌4℃保存临用时用水稀释10倍0.5×TBE缓冲液（PH8.0）【0.5MEDTA（PH8.0）溶液】水800ml+EDTA-2Na186.1g剧烈搅拌用NaOH调pH值至8.0（约需20gNaOH颗粒）定容至1L分装后高压灭菌备用。注意：EDTA-2Na在PH值接近8.0时才能完全溶解。2.1.0%琼脂糖溶液琼脂糖0.5g+0.5×TBE缓冲液50ml放入锥形瓶中混匀微波炉中加热溶解六、实验步骤（一）1%琼脂糖凝胶的制备1.选择合适的凝胶托盘放置于制胶器的合适区域。2.称取1g琼脂糖置于250ml锥形瓶中，加入100ml0.5×TBE缓冲液。3.将锥形瓶放入微波炉中加热使琼脂糖充分溶解。4.将5µlGoldView核酸染色剂加入其中，摇晃充分混匀。5.待胶冷却至60度左右，将融化的琼脂糖小心的倒入制胶器中，速度要快，再把梳子（试样格）插入凝胶托盘两边槽内。6.让胶自然冷却至完全凝固（约需20-30分钟）。小心的将梳子拔出（注意先拔一侧），将胶连同凝胶托盘放入电泳仪中，加入0.5×TBE缓冲液，使缓冲液没过凝胶1-2mm（注意加样孔靠近负极一端）。如样品孔内有气泡，应除去。（二）加样1.将适量的DNAMarker用移液枪加入凝胶的第一个孔中。2.在PCR产物中加入6×DNALodingBuffer（每5ul产物加入1ul），混匀后，用移液枪加入到样品孔内，每孔加2ul。3.盖好上盖，连接电泳仪电源与电泳仪之间的电泳导线，注意不要接错正负极。4.调好电压，打开电源开始电泳，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。（三）凝胶紫外观察：凝胶取出于紫外监测仪或凝胶成像系统中观察，照相，保存，记录结果。七、注意事项1.琼脂糖融化时，档位不宜太高。2.制胶和加样过程中要防治气泡的产生。3.必须戴手套操作，严格注意防护。4.加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐。5.电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。6.电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。将两者混匀后加入点样孔，注意枪头尽量往下，同时防止气泡产生。八、思考题影响DNA迁移速率的因素有哪些？