实验方法-AFLP实验操作指南

AFLP实验操作指南一、实验操作流程1．DNA样本的准备把DNA样本用紫外光（或荧光）分光光度计精确的测取浓度，然后将其稀释成浓度为50ng/ul，体积为50ul的溶液，如果DNA样本不多，在保证浓度的情况下体积可以适当减少。2．DNA酶切（1）反应体系成分体积（ul）双蒸水11.4缓冲液（Yellowbuffer）4EcoRI(10u/ul)0.5MseI(10u/ul)0.1模板DNA（50ng/ul）4总体积20（2）反映程序37℃反应3个小时，最后保存于4℃。（3）检测取4－6ul酶切液进行酶切效果检测，跑出的带以弥散状、无明显主带为好。琼脂糖电泳用6×loadingbuffer：名称用量（武汉）用量（广州）Ficell400（蔗糖）12g40gEDTA(0.5MPH=8.0)12ul10%SDS（十二烷基四磺酸钠）6mlBromphenolBlue（溴酚蓝）25mg25mgXyleneCyanoleFF（二甲苯青FF）25mg25mgddH2Oaddto100ml100ml3．连接接头（1）接头的制备a、按公司说明书将引物单链稀释成高浓度(一般是5OD稀释成1650ng/ul)溶液储存于－20℃冰箱。b、取部分引物单链稀释成100uM/l，然后两条正反单链混合，体积比如下：10ulEcoR1正链、10ulEcoR1反链和180ulTE混合成200ulEcoR1接头；100ulMseI正链、100ulMseI反链混合成200ulMseI接头。c、反应程序：95℃下5min，65℃下10min，37℃下10min，25℃下10min，保存于4℃。最终储存于－20℃冰箱。（2）连接反应体系成分体积（ul）双蒸水7.6反应缓冲液（T4DNA连接酶自带）2.5EcoR1接头1MseI接头1T4DNA连接酶（5u/ul）0.4酶切反应后溶液12.5总体积25（3）反应程序21℃保存过夜。附：酶切和连接之间不要停止。（4）稀释按1：10的比列稀释，已稀释的和未稀释的均可长时间储存于－20℃备用。实验进行到此处可以暂停。4．预扩增（1）反应体系成分体积（ul）双蒸水10.3缓冲液（10xTag酶自带）2dNTPs(10Mm)0.4EA00(50ng/ul)1MC00(50ng/ul)1MgCl2(25mM/l)(Tag酶自带)1.2Tag聚合酶（5u/ul）0.1稀释后已连接DNA模板4总体积20（2）反映程序a、94℃2minb、94℃30sc、56℃1mind、72℃1mine、重复b～d25次f、72℃5ming、保存于4℃（3）稀释取部分预扩增后溶液按1：25的比例稀释(稀释比例可以自己适当调整)。将已稀释的和未稀释的保存于－20℃储存。实验进行到此处可以暂停。（4）检测取未稀释的预扩增产物4－6ul进行琼脂糖电泳检测。5．选择扩增（1）反应体系成分体积（ul）双蒸水1.6缓冲液（10xTag酶自带）1dNTPs(10mM)0.2EA--(15ng/ul)*2MC--(15ng/ul)*2MgCl2(25mM/l)(Tag酶自带)0.6Tag聚合酶（5u/ul）0.1预扩增稀释后模板2.5总体积10*:EA--,MC—后面两个碱基因不同引物对而不同。（2）反应程序a、第1个循环：94℃4min,94℃30s,65℃1min,72℃1min；b、第2～13个循环：94℃30s,65℃1min,72℃1min（退火温度每隔一个循环降低0.7℃）；c、第14～36个循环：94℃30s,56℃1min,72℃1min；d、72℃5min,4℃保存。6．变性（1）变性剂（Loadingbuffer）配方组分体积去离子甲酰胺（DeionizedFormamide）50mlEDTA(0.5MPH=8.0)1ml二甲苯腈FF(XyleneCyanoleFF)0.125g溴酚蓝（BromphenolBlue）0.125g（2）变性将3/4体积（或者1/2即可）的变性剂加入PCR反应产物，95℃变性5min，立刻保存于4℃或置于冰上直到上样电泳。（3）新的变性剂配方组分体积终浓度去离子甲酰胺（DeionizedFormamide）95ml95%溴酚蓝（BromphenolBlue）50mg0.05%二甲苯腈FF(XyleneCyanoleFF)50mg0.05%NaOH(100M)1ml(或直接称0.04g)1M7.制胶溶液（1）一块胶的配方将12ml5XTBE和25.2g尿素（Urea）混合加水定容至51ml，向其中加入9ml40％的丙烯酰胺溶液，400ul10%过硫酸胺（APS）和30ul四甲基一二胺（TEMED）。（2）各组分配方5XTBE：54gTris碱（Tris-base）,27.5g硼酸（B-acid）和20mlEDTA(0.5M,PH=8.0)混合定容至1000ml。（室温放置）尿素储备液：270g尿素，加入120ml5XTBE，再加少量的水即可定容到510ml。切记加水要慢！非常容易过量，大约100ml左右即可。（室温放置）40％丙烯酰胺溶液：2g甲叉丙烯酰胺（N、N-MethyleneBisacrylamide）,38g丙烯酰胺（Acrylamide）混合加水定容至100ml。（4度保存）10％过硫酸胺溶液：1g过硫酸胺（APS）加水定容至10ml。（4度保存）8.亲水和疏水处理及灌胶（1）长玻璃（亲水玻璃）处理：a、亲水剂制备：1.5ml95%酒精，3ul亲水硅烷（BindingSilane）,7.5ul冰醋酸混合。此为一块板用量。b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。待晾干后再开始亲水处理。c、先用约2ml95％的酒精涂擦玻璃板，保证板子清洁。d、用手巾纸浸亲水剂涂擦玻璃板。e、干燥5分钟，用约2ml95％的酒精再轻轻涂搽玻璃板（以均一方向）然后再垂直方向涂擦一遍。e、晾干约10min（不少于10min）。（2）短玻璃（疏水玻璃）处理a、换手套，以防亲水剂和疏水剂交叉污染。如果出现污染情况，可将玻璃浸入10％的NaOH溶液中。b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。待晾干后再开始疏水处理。c、用纸巾浸疏水剂(Repel-silaneES)涂搽玻璃板，要均匀。d、用约2ml95％的酒精涂擦玻璃板，保证板子清洁。e、干燥5分钟，用约2ml95％的酒精再轻轻涂擦玻璃板（以均一方向）然后再垂直方向涂擦一遍。f、晾干约10min（不少于10min）。g、疏水处理做一次大约可以跑5块胶再做或当出现轻微扯胶情况时再做。（3）将长玻璃放在水平的泡沫垫上，亲水面向上，将两个胶条平行分置于其较长的两边，然后轻轻放上疏水玻璃，疏水面向下。这样在两玻璃间形成了一个矩形空隙。用夹子夹住固定。（4）用胶带将左右两边和底边封上，留出插梳子的边（有凹边的那一边），封时要均匀不留气泡。（5）将梳子插入有凹边的缝隙，看是否容易均匀，不行要适当调整。（6）将有凹边的那边稍稍垫高，然后配胶用注射器筒灌入，要从一边均匀灌入，胶中不留气泡。（7）将梳子平直边插入凹口缝隙，以形成一个胶的平直端。注意其端线应与玻璃板的长边垂直。（8）让胶至少聚合两个小时。9.电泳（1）将电泳槽底盒装入400ml1XTBE缓冲液，上盒装入500ml1XTBE缓冲液。（2）轻轻拔掉梳子，固定玻璃于电泳仪上，到入上盒缓冲液，用1000ul枪冲洗凹口缝隙，冲干净为好，65W预电泳30min。（3）预电泳完毕断开电源，再次冲洗缝隙，然后将梳子齿端插入凹口缝隙，其齿尖端轻轻的插进胶中，以构成点样孔。（4）点入3.0～4.5ul变性后的样品。（5）65W电泳约两个半小时，直到上边那条浅蓝色的指示带到离顶端2/3为好。（6）电泳完毕，分开两玻璃板，将固着胶的亲水板放入预先准备好的10％的醋酸固定液中浸泡固定脱色。10.银染（1）脱色：2升10％冰醋酸溶液（固定/停止液），轻轻摇20分钟至全部脱色。附10%冰醋酸配方：200ml冰醋酸与1800ml双蒸水混合。（2）冲洗：用双蒸水漂洗三次，每次5分钟。（3）染色：加染色液，染色20～30分钟。附染色液配方（用前10分钟配）：在两升双蒸水中加入2gAgNO3，3ml37％甲醛。（4）漂洗：双蒸水冲洗胶板不超过5秒钟。（5）显影：在2升冷却的显影液中轻轻的摇动，直至带纹的出现。附显影液配方：在2升双蒸水中加入60gNaCO3，完全溶解后放入4℃冰箱冷却至4℃（可在使用前5小时配）；使用前5分钟加3ml甲醛，10mg/ml硫代硫酸钠400ul。（6）定影：加入等体积的固定/停止液（即脱色中所用的），固定2分钟。（7）冲洗：用双蒸水冲洗2次，每次2分钟。（8）胶的干燥：室温下自然干燥。10.新银染方法：（1）将凝胶浸在固定液（10%乙醇，0.5%冰醋酸）中5min；（胶面向下？）（2）将凝胶浸在染色液（10%乙醇,0.5%冰醋酸,0.2%AgNO3）中8min；（胶面向下？）（3）在水中短时间地冲洗凝胶（5-10秒）（4）将凝胶浸在显影液（3%NaOH,0.1%甲醛）中，直到带纹出现。（胶面向上）（5）将凝胶浸在固定液中固定5min。溶液配方：固定液：无水乙醇100ml，冰醋酸5ml,水895ml；染色液：无水乙醇100ml，冰醋酸5ml,水895ml，AgNO3(ACS试剂)2g；显影液（每次使用都要新配）：30gNaOH,1ml甲醛,水1000ml.