寡义反核苷酸的设计及使用

Morpholino的设计及使用发育生物学家们（他们所使用的模型动物在遗传学方面的研究往往还不完善，当然有的动物已经研究得很完善了）所面临的很重要的问题之一是如何在生物体发育时期抑制他们所感兴趣的基因的活动——这样一来生物学家们就可以研究这个基因的正常的生物学功能了。一项被广泛接受的方法是反义技术——尤其是反义寡核苷酸（morpholino，简称MO）技术。在本文中，我们将简述该药物（指MO）的使用，并举例说明它们如何应用于发育机制的研究。我们还将讨论怎样应用MO就会导致产生错误的结果——包括没能将目的基因靶向敲除，同时我们建议研究人员使用对照实验，这样就能对MO实验作出正确的解释。简介为了理解发育早期的分子机制，发育生物学家们长期以来一直希望能有这样一种技术，即：可以在特定的发育时期、在特定的细胞中阻断特定的基因的表达。这一目标目前还没有实现，尽管研究人员在小鼠胚胎上已经很接近这一最终目标了——他们使用的方法是靶向突变和Cre重组酶。即便如此，仍有很多困难没有克服：试图干扰某一个基因的功能往往会对另一个基因产生不希望发生的“副作用”，而使用Cre重组酶则需要警惕Cre基因表达时所具有的潜在的毒性作用。其它物种又如何呢？毫无疑问，对其它脊椎动物和无脊椎动物的研究已经深入到了研究在发育早期的基本机制的地步，而且与使用哺乳动物胚胎为研究对象相比，使用这些动物具有很多明显的优势——包括可接受性、成本、时间，此外这些动物本身就很令人感兴趣。在所有这些动物中，目前都还没有建立常规的基因打靶技术。尽管传统的遗传筛查技术在理解某一特定的过程方面具有不可估量的价值，但它既不能保证具体到特定的目的基因，也不能保证使生物体产生一种无效突变。总之，研究人员需要一种能阻断基因功能的方法。显性抑制方法有一定的应用价值，但不是最佳的选择。最佳的选择是具备较高特异性的反义RNA技术。反义RNA技术不但可以用于脊椎动物，还可以应用于组织细胞中，而且它们在寻找新药方面正在发挥越来越大的作用。RNA干扰（RNAi）和寡义反核苷酸（MO）技术对我们理解胚胎发育早期基因的功能有巨大的影响。但这两项技术是否是已经好的足够可信呢？所有的反义技术都存在“脱靶”的可能。这些副作用让人们很难判断最终出现的表型究竟是靶基因被敲除所导致的还是靶基因以外的其他基因被敲除所导致的。要理清这一问题需要进行全面而又严格的对照试验。在这里，我们将讨论用反义技术（主要集中在MO实验及其对照）研究动物发育时采取何种对照试验较为合适，并针对在斑马鱼和青蛙中进行上述对照实验时提出了若干建议。这些问题在进行针对果蝇和哺乳动物细胞的RNA干扰实验时就已经被讨论过。在进行针对其它物种的MO实验以及治疗应用时，我们所提出的有关对照试验的部分建议仍然是很重要的。反义技术将反义RNA导入细胞以阻断内源性mRNA的翻译、加工或其稳定性的设想是在20多年以前提出来的。这项技术已经被证明能够成功地抑制外源性RNA（注射到非洲爪蟾卵母细胞中的外源性RNA）的翻译过程，同时也能抑制内源性mRNA的翻译。而由Heasman和Wylie于1997年开发的反义寡核苷酸技术则能够让研究人员研究青蛙卵母细胞中从母体遗传来的基因转录本的功能（例如包括Vg1和VegT基因编码的转录本）。在上述例子中，这些反义药物是通过与内源性的RNA杂交并通过核糖核酸酶H（RNaseH）介导这些内源性RNA的降解而干扰基因的功能的。令人惊讶的是，在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）中进行的研究表明，双链RNA同样可以干扰内源性基因的功能。这一工作导致了动物体内小的、非编码的RNA家族的发现（这些RNA可以调节许多——如果不是全部的话——基因表达方面的功能）。2006年的诺贝尔奖就授予了“双链RNA介导干扰”这一现象的发现者。至少在青蛙中，除少数例外情况外，在用传统的反义RNA、反义寡核苷酸或RNA干扰的方法研究青蛙受精卵中表达的基因的作用时并未获得成功。与之相类似，在斑马鱼中，反义RNA作用的特异性太低，以致这一技术无法实际应用于针对斑马鱼发育过程中某一特定基因的功能的研究。也许以后会有新的方法使上述技术（如RNA干扰）在青蛙和斑马鱼中的应用成为可能，但目前看来这些技术还是不实用的。在确定基因功能时所遇到的这些问题阻碍了发育生物学的发展。直到本世纪初，人们才欣喜地发现寡义反核苷酸（MO）能够在青蛙和斑马鱼体内将特定的基因靶向敲除。MO在研究基因功能方面的威力迅速被人们所知晓并在其它生物体中得以推广应用，包括热带爪蟾、鸡、海鞘、家鼠的卵母细胞以及紫色海胆。2001年7月的《遗传》杂志（journalGenesis）用一整期特刊的形式通报了MO技术在推动发育生物学发展方面的重要性，这一期特刊全部用于介绍在多种生物体中应用MO进行的基因打靶方面的研究。MO是一种人工合成的寡核苷酸序列，其链的长度大约为25个碱基左右。其结构与短序列的DNA或RNA类似，只不过是用吗啉环替换了核糖环（图1）。MO的这一结构使其仍然能够与核酸分子的碱基互补配对，但与一般的寡核苷酸相比它具有明显的优势。特别的，MO能够抵抗核酸酶的降解，因此其化学特性十分稳定（详见下文）。同时MO的主链不携带负电荷，这意味着MO不易与胞内的其他组分发生非特异性的反应，因此MO的毒性作用也较低。MO并不是通过核糖核酸酶H（RNaseH）的机制来发挥作用的，相反，它是通过阻断翻译过程而发挥作用的（图2A）。最近有实验表明，MO可以阻断RNA的正常剪接（图2B-E）。正如我们在本文中所讨论的，现在MO的用途十分广泛。例如，一项最近的研究表明，理论上有可能使用MO在脊椎动物胚胎（如非洲爪蟾）中进行基因组规模的筛查（正如用RNAi在秀丽隐杆线虫胚胎或在黑腹果蝇组织细胞中所进行的一样）。这项研究还表明带有荧光的MO可被用于研究MO在胚胎中的分布情况。最近，已经有人用光激活的MO来进行基因敲除后的对照研究，这增加了对胚胎特定区域的基因进行靶向敲除的可能性——甚至是在特定发育时期的单个细胞中（图2F）。最后，MO还可用来封闭microRNA（研究双链RNA时在动物体内发现的一种非编码RNA家族）的功能。MO既可以封闭成熟的microRNA又可以封闭microRNA的前体。反义寡核苷酸在青蛙、斑马鱼和其他生物体中的应用关于MO在发育生物学中的应用的最早的描述出现在8年前（2000年）。从那以后发育生物学界就以极大的热情接纳了MO技术。MO技术简便易行（尤其是在斑马鱼和青蛙中）、得到的结果精确，这些优点意味着在任何一篇描述了一个新基因的论文中都不能省略用MO对该基因进行敲除实验的内容（这是为了了解该基因的正常功能）。然而，在这种对MO的巨大热情背后有一个不幸的副作用——由于没有建立合适的对照标准，因此很多发表的研究成果中所描述的表型很可能是MO“脱靶”将其它基因敲除（而不是将感兴趣的目的基因敲除）后所导致的。我们写作本文的目的之一就是为了讨论这一问题并提出了一系列的标准化对照措施；我们所提出的这些措施的基础是由Corey和Abrams在2001年所奠定的。阻断翻译的MO许多研究中使用的MO可以直接阻断目的mRNA的起始编码区。这种MO对那些研究基因组序列未知的模式生物的研究人员特别有吸引力（当然，这一情况越来越少了），因为这样一来研究人员在不知道目的基因的内含子-外显子的具体结构的情况下就能阻断目的基因的功能。人们已经广泛地研究了如何设计阻断翻译过程的MO，而且设计时所应遵守的规则相对简单（见表1）。应用了阻断翻译过程的MO的例子是如此之多以致我们很难一一道来。在这里我们只举两例，其中一例来自我们实验室。这两个例子都是关于在发育过程中的某种蛋白质的作用的。第一个例子采用的技术路线很直接，而第二个例子主要是讲如何用检测手段来解决难题。在第一个例子中，MO被用来研究Notch信号分子在斑马鱼神经系统发生中的作用。在缺少Notch信号分子的情况下，原本要发育成躯干神经板的细胞结果却发育成了过量的罗-比（Rohon-Beard）感觉神经元，这表明Notch信号对神经板的分化是必需的。然而，用MO将Neurogenin1（Neurog1，一种原神经蛋白）敲除后发现Notch信号只有在阻断神经发生中才是必需的，因为在Notch信号分子和Neurog1分子都缺少的情况下能够形成正常的躯干神经板。在第二个例子中，MO被用来研究在早期非洲爪蟾胚胎中激活素（activin）的功能。长期以来一直认为激活素具有强大的诱导两栖类胚胎中胚层分化的能力，但其在一般发育过程中的作用却一直不清楚，直到MO技术出现后人们通过用MO阻断激活素的功能才对其有所了解。在这些阻断实验中，有一种MO可被用于阻断激活素B基因mRNA的翻译进而引起发育缺陷，同时伴有若干中胚层标记物的下调（这种下调具有浓度依赖性）。同时还设计了一种对照MO（这种对照MO改变了原MO末端的4个核苷酸），实验表明这种对照MO不具有敲除效应，这提示我们激活素基因敲除后引起的表型是特异的。但是，令我们感到惊讶的是，当我们使用作用靶点位于激活素mRNA的5’端的MO时则观察不到表型——我们原先推测这种MO具有同样的阻断激活素B基因翻译的效应。最终，我们发现我们实验室从非洲爪蟾中提取并保存的激活素B的mRNA的5’非翻译区的序列与公开公布的不同，也就是说，我们所用的第二种MO由于存在2个碱基的差异而无法与靶点结合。当我们重新设计了合适的MO并把它注入非洲爪蟾的胚胎中时，敲除表型才再次出现——这表明（但不是证明）MO的效应是特异性的。“拯救”实验（详见下文）同样表明MO所发挥的效应是特异性的。我们在后来进行的实验中还证明激活素基因功能的丧失会引起参与细胞周期调控的基因功能失调。除在研究激活素B的功能时提供了新的方法外，这些实验还强调在研究中对MO作用靶点的序列进行重新测定是很重要的，这样能避免被单核苷酸多态性位点（SNPs）或公布的测序结果中的错误所误导。阻断断裂剪接的MO由于要确保设计的MO（阻断翻译过程的MO）确实能够阻断蛋白合成并表现出预期的表型（详见下文）存在一定的困难，因此人们开始研究用MO阻断mRNA前体的断裂剪接甚至引发外显子“跳跃”的可能性。抑制断裂剪接过程的MO有如下优势：即，人们可以对这种MO的效应进行量化。此外，由于这种MO不会影响已经剪接完成的母源性转录本，因此当所研究的基因具有从卵细胞中遗传来的mRNA时其突变后的功能仍然可以被模拟出来。阻断断裂剪接过程的MO常常与阻断翻译过程的MO平行使用以便让它们的数据相互验证。与阻断翻译过程的MO一样，关于使用阻断断裂剪接过程的MO也有许多例证。在此我们选择了两个例子，其中一个出自我们的的实验室。在第一个例子中，Eisen的实验室发现，用两种不同的阻断断裂剪接过程的MO将斑马鱼Islet1基因敲除（单独或共同注射）会导致相同的表型。在这个例子中，注射了MO的胚胎在发育过程中其运动神经元具备了中间神经元的特征。这证明Islet1的功能为促进运动神经元的分化并抑制一些位于腹侧的的中间神经元的分化。在第二个例子中，Smith研究小组研究了神经素营养因子受体的同源蛋白（NRH1）在青蛙胚胎中胚层形成过程中的功能。他们设计了两种MO，均以两种非洲爪蟾的神经素营养因子受体相关蛋白的mRNA起始转录位置为作用靶点。实验结果表明NRH1对早期胚胎中Xbra和Chordin基因的表达是必需的，但Goosecoid基因的表达并不十分地依赖于与NRH1受体有关的信号。在热带爪蟾（一种二倍体生物，其基因组序列已被测定）中使用一种阻断NRH1翻译的MO，以及另外两种阻断正常断裂剪接的MO后仍然可以观察到Xbra和Chordin基因的下调。即，在两种不同的生物体内获得了相似的结果，并且使用的MO既有阻断翻译的也有阻断正常断裂剪接的，这一事实提示观察到的效应是特异性的。关于如何设计最好的阻断正常断裂剪接的MO，人们已经作了相当多的工作。与设计阻断翻译的MO相反，设计阻断正常断裂剪接的MO时并没有一个普遍的指导原则——因