基因工程3

第七章重组DNA的连接、转化和筛选第一节目的DNA片段与载体的连接外源DNA片段与载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA连接酶：T4DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。T4DNA连接酶在分子克隆中主要用于：１、连接具有同源互补粘性末端的DNA片段；２、连接双链DNA分子间的平端；３、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。一般说来，在选择外源DNA同载体分子连接反应的程序时，需要考虑到以下三个因素：1）实验步骤要尽可能简单易行；2）连接形成的“接点”序列应能被一定的核酸内切酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；3）对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：（一）、具互补粘性末端片段之间的连接大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。若外源DNA插入片段和适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。但是，在同源粘性末端连接方案中，存在以下两个弊端：高背景和两向插入。高背景：连接物中除重组子以外，还有相当数量的载体自身环化分子，这将产生转化菌中较高的假阳性克隆背景。针对这一问题，往往需要在连接前，将切割后的线性载体DNA分子用碱性磷酸酯酶进行5’端去磷酸化处理。两向插入：由于载体与插入片段之间的末端全为粘性互补顺序，所以插入片段插入载体中存在两个方向。对于原核或真核表达型重组子的构建，反向插入的重组子，由于插入片段的转录及翻译阅读方向与载体启动子转录方向相反，产物的表达困难，或表达出完全不同的产物，故必须筛选出正向连接的重组子。其解决办法是将重组子进行内切酶图谱分析，以鉴定重组子中插入片段的方向。目前，采用所谓的定向克隆技术，可以使外源DNA片段按一定方向插入到载体分子。定向克隆：根据核酸内切限制酶的性质，用两种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子，将会产生出具有两种不同粘性末端的DNA片段。十分明显，如果载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对核酸内切酶切割，然后混合起来，那么载体分子和外源DNA片段将按一种取向退火形成重组DNA分子。互补粘性末端连接方案中还有一个问题：片段的多拷贝插入。当需要表达蛋白质产物时，多拷贝的插入，在没有拼连剪切信号的情况下，将会导致表达困难或紊乱。所以需要用内切酶图谱对单拷贝插入片段进行鉴定和筛选。适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般比例为21（插入片段摩尔数载体摩尔数）。（二）、平末端的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平末端的连接速度为粘性末端的1/10~1/100。为了提高平末端的连接速度，可采取以下措施：（1）增加连接酶用量，通常使用粘性末端连接用量的10倍，但是实际操作中，这种方法并不常用，因为酶量加大，反应体系中甘油的浓度也提高，有时对连接反应不利；（2）增加DNA平末端的浓度，提高平末端之间的碰撞机率；（3）加入NaCl或LiCl以及PEG；（4）适当提高连接反应温度，平末端连接与退火无关，适当提高反应温度既可以提高底物末端或分子之间的碰撞机率，又可增加连接酶的反应活性，一般选择20℃~25℃较为合适。既然在一定反应条件下，用T4DNA连接酶可以将平末端的DNA片段有效地连接起来，那么对于上面提到的非互补粘性末端的两种DNA片段之间，经过专门作用于单链DNA的S1核酸酶处理变成平末端或用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段填补后变成平末端，一样也可以使用T4DNA连接酶进行有效地连接。不过，平末端DNA片段间的连接作用不仅在效率上明显地低于粘性末端间的连接作用，而且重组之后一般不能从原位删除下来。平末端连接的另一个特点是可以恢复一个原始的酶切位点，甚至产生一个新的酶切位点。例如，EcoRI识别G/AATTC序列，切割后产生3’-CTTAA-5’的5’端突出的粘性末端，用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段填补后，末端填平为5’-GAATT-3’,若与一个5’端为C的平末端DNA连接，如HaeIII(GG/CC)的酶解DNA片段，连接后则恢复EcoRI的识别切割位点。BamHI酶也一样（BamHI识别G/GATCC序列）,即EcoRI和BamHI酶切产生的末端，填平后，只要另一个片段末端能供给一个5’C，如HaeIII酶切或TaqI酶切并填平的末端（识别T/CGA），两种酶的识别位点都可以恢复。有些特殊情况下，两个不同的内切酶位点产生的末端填平后，其连接成的序列，可产生出另一种内切酶的识别切割位点，在克隆位点选择时，也是一种可以考虑的方案。例如BamHI与BglII的末端填平连接后，可产生一个ClaI的切割位点。平末端连接没有粘性末端的碱基互补限制，只要是平末端均能连接，所以平末端外源DNA片段在载体中的插入方向有两种可能性，在重组子筛选后，应该利用内切酶图谱对阳性重组子中外源DNA片段的插入方向进行鉴定。另外，由于平末端连接要求较高的底物浓度，故载体中多拷贝的外源DNA插入现象在所难免，因此应该利用加大连接酶浓度、降低ATP浓度、载体去磷酸化、用PEG促进连接等其它措施提高连接效率，不要过分加大外源DNA的浓度，从而减少多拷贝插入的机率。当然，重组子还需内切酶酶解鉴定，筛选插入单拷贝外源DNA片段的重组子。（三）、DNA片段末端修饰后的连接待连接的两个DNA片段的末端未必都是平末端，或者未必都是互补的粘性末端，两个不能互补的粘性末端原则上不能直接连接，虽然可以采用上述方法将它们转化成平末端后再进行连接，但是，所产生的重组子往往会增加或减少几个碱基对，并且破坏了原来的酶切位点，使重组的外源DNA片段无法回收；如果连接位点位于基因编码区内，则会破坏阅读框架，使之不能正确表达。在这种情况下，连接之前必须对两个末端或一个末端进行修饰改造。常采用以下几种方法：1）DNA连接子技术（人工接头连接）DNA连接子是等摩尔数的两条完全互补的寡聚脱氧核糖核苷酸链，形成的平末端双链DNA序列中含有一个或多个限制性内切酶位点。DNA连接子的作用主要是在DNA平末端添加新的内切酶位点以产生粘性末端，便于DNA片段之间的连接，是亚克隆技术及基因文库构建中一项常用的技术。连接子大小一般为8~12bp核苷酸长的一段迥文序列，接受连接子的DNA片段必须是平末端，对于粘性末端则需预先修饰成平末端。而且只有5’末端磷酸化的连接子才能在T4DNA连接酶的催化下进行连接反应，5’末端去磷酸化的连接子需要用T4多核苷酸激酶在其5’末端磷酸化后，才能成为连接酶的适合底物。使用连接子进行亚克隆操作包括三个步骤：①将连接子连接于外源DNA片段两侧——平末端上；②用相应的内切酶切割连接子；③含新的粘性末端的外源DNA片段与相应的线性载体DNA分子连接。由于连接子分子量小，很容易达到DNA平末端连接所需的高末端浓度，一般连接子的末端浓度必须高于靶DNA末端浓度的2~3倍。另外，4~20mol/L连接子末端浓度才能驱动T4DNA连接酶的连接反应，这样靶DNA的浓度就可以较低。如果靶DNA片段中有与连接子相同的内切酶位点，在添加连接子之前，必须预先用相应的甲基化酶进行修饰，防止内切酶切割连接子时降解靶DNA片段。2）DNA适配子技术DNA适配子是一条人工合成的具有一个以上限制酶识别位点的寡聚脱氧核糖核苷酸链，它含有某种限制酶的粘性末端的突出顺序，不需用内切酶切割而产生。在DNA重组中，通过与其它适配子或连接子互补配对，形成双链DNA，再与靶DNA连接，可适用于各种类型的DNA末端之间的连接。它克服了连接子只适用于DNA的平末端连接和还需要用内切酶消化才能产生新的粘性末端的两个弊端。适配子在不同类型DNA末端连接中的应用：①
平末端DNA分子产生新的粘性末端：将BamHI的适配子与HapII的连接子退火，将产生一端平一端粘的双链DNA分子，其平端与平末端DNA分子相连后，靶DNA分子双侧形成BamHI的粘性末端，而BamHI适配子5’端脱磷酸防止了适配子之间聚合，这样可以直接克隆到含BamHI位点的载体中去。②直接使两个非互补的粘性末端连接：A：将一种内切酶切割的外源DNA片段插入到另一种内切酶切割的载体中。例如：将EcoRI适配子和BamHI适配子联合，能够使EcoRI切割的外源DNA片段直接与BamHI切割的载体DNA连接，其中一个适配子5’端去磷酸化，使得配合的两个适配子双链DNA片段不能自身连接。通过适配子使插入片段与载体DNA连接后，连接处除了BamHI和EcoRI外，还产生了一个新切点XhoI。B：适配子填平连接5’突出与3’突出粘性末端。以上这个方案适应于外源DNA与线性载体DNA分子的粘性末端均为5’或3’突出，如果两者之间，一个为3’突出末端，一个为5’突出末端，连接两个分子，其接端存在一个较大的缺口，可以考虑由适当的适配子填补。例如：用适配子5’-pAATTCCTGCAOH-3’连接EcoRI（5’突出粘性末端）和PstI（3’突出粘性末端）产生的末端。适配子添加到DNA片段末端上的操作与连接子几乎相同，一般也需要较高的摩尔浓度（10~20mol/L）。唯一不同的是有些适配子需要退火处理，再与DNA连接。3）同源多聚尾序连接同源多聚尾序包括dA:dT和dG:dC两种类型。在DNA分子末端添加同源多聚尾序，一般由末端脱氧核苷酸转移酶催化，该酶是一个分子量为80kD的多肽分子，它能在单链、双链DNA的3’-OH上添加脱氧核糖核苷酸，其最适底物是具有3’端突出的双链DNA。对于平末端和5’端突出的双链DNA催化活力不高，需要用核酸外切酶处理，删切5’端部分碱基，形成3’端突出端，添加dA或dT尾序时，可用Ca2+为辅助因子，而Mg2+则适用于dG或dC尾序的添加。同源多聚尾序克隆方案存在两个缺陷，一是DNA分子内部必须完整，即在两个DNA链中间不存在裂口，否则游离的3’-OH会因添加多聚尾序而分支，破坏了载体的活性；另外DNA末端加尾破坏了该部位的内切酶位点，同时添加了许多核苷酸顺序，影响了外源DNA片段表达的真实性，并且在多数情况下，外源DNA片段不能从载体上完整地切割下来。对于有些内切酶切割DNA产生的末端，添加适当的尾序可以保留原内切酶的识别位点。如PstI的粘性末端为3’突出（5’-CTGCAG-3’），添加(dG)n外源DNA形成的重组子，仍然保留PstI位点。具有相似功能的酶还有KpnI(5’-GGATCC-3’)+dC、SstI(5’-GAGCTC-3’)+dC、HaeIII(5’-GGCC-3’)+dC等。还有两种方法从同源多聚尾序的重组子中切割插入片段，dA:dT尾序相对不稳定，在45~50%的甲酰胺存在下，