基因克隆步骤完整版

1总RNA提取(1)液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1mlTrizol加到离心管中待用(2)将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5min；打开离心机预冷(3)加200µL氯仿，振荡15sec，室温放置3min，分层；(4)4oC，12,000g，离心15min；(5)取上清，加500μL异丙醇，混匀，室温放置10min；(6)4oC，12,000g，离心10min；(7)弃上清，加1mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8)4oC，7,500g，离心5min；(9)弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50μLDEPC水，－80oC保存。此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总RNA浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentwithgDNAEraser(PerfectRealTime)说明书进行。其体系为：TotalRNA1μg5×gDNAEraserBuffer2μLgDNAEraser1μLRNaseFreedH2O补齐至10μL条件为：42oC，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。其体系为：5×PrimeScriptBuffer2（forRealTime）4μLPrimeScriptRTenzymemixⅠ1μLRTPrimerMix1μL上一步的反应液10μLRNaseFreedH2O补齐至20μL操作条件为：(1)37oC放置15min；(2)85oC，5sec；(3)4oC保存。3PCR按TaKaRa公司的PremixTaqVersion2.0操作，，PCR反应体系如下：PremixTaq25μL模板5μL引物1(10μM)1μL引物2(10μM)1μLddH2O18μLPCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。PCR反应完毕，取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反应产物）。4基因克隆及测序4.1PCR产物切胶回收将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA片段。使用TIANGEN公司的UniversalDNAPurificationKit割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下：(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，13,400×g离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(2)按100mgagarose胶加入100μL溶液PC，置于50oC中10min左右，中途混匀几次，至胶完全融化；(3)将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(5)重复上一步骤；(6)将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；(7)将柱子套入一新的灭菌1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50µL洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400×g室温离心2min，收集到的洗脱液即为回收的DNA纯化液；(8)取5µL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液中DNA含量。4.2目的片段与载体连接(1)胶回收产物与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18-T载体的试剂盒说明书。在灭菌的0.5mL离心管中配制如下溶液（10μL）：回收DNA4μLLigationSolution5μLpMD18-TVector1μL(2)16oC反应30分钟，所得产物保存于－4oC冰箱备用。4.3连接产物转化E.coliDH5α(1)将5µL连接产物加入到100µLE.coliDH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30min；(2)42oC水浴热激转化90sec，立即放回冰上，放置3min；(3)每管加入500µLLB培养基（室温放置），37oC160-180rpm振荡培养45-60min，使菌体复苏并表达抗性基因；(4)在含有Amp（100µg/mL）的选择性平板上加入60-100µL菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；(5)将培养皿正放，37oC约50min，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养10-16h。4.4转化子的筛选及鉴定(1)用无菌枪头挑取LB平板上3-5个单菌落，分别接种到3.5mLLB液体培养基中（含100µg/mLAmp），37oC，165rpm振荡培养10-12h；(2)用5µL菌液做模板，进行PCR鉴定（50µL体系），操作步骤同3。阳性菌液由Invitrogen生物公司测序鉴定，余下的菌液4oC保存备用；(3)测序结果在Genbank数据库中进行比对分析。