基因工程复习

基因工程复习1、荧光定量PCR为什么设内参基因，该基因选取的标准是什么。答：内参基因是指其表达水平不受研究条件的影响，且可以在多种样本间恒定表达的已知参照基因，用这个基因的表达水平可以准确量化初始材料的载量。由于管家基因的表达水平受环境因素影响较小，并能在生物体几乎全部组织及各个生长阶段持续表达，所以在试验中通常选用管家基因作为内参基因。该基因的选区标准为：（1）不存在假基因，避免基因组DNA的扩增（2）过度或中度表达，排除太高或太低表达（3）稳定表达于不同类型的细胞或组织，而且表达无显著差别（4）表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关（5）其稳定表达水平与目标基因相似（6）不受任何内源和外源性因素的影响2、比较Northernblot与RT-PCR的差异与优缺点。Northernblot是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northernblot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。优点：特异性高、可检测目的片段的大小、是否具有可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用；缺点：RNA用量高、反应不灵敏，耗时长。RT-PCR是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。首先经反转录酶的作用以RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。优点：反应灵敏、简便；缺点：特异性低。3、RNA干涉与CRIPR/CAS9的不同点RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。Cas9系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（shortguideRNA），足以引导Cas9对DNA的定点切割。RNAi的实质是RNA干扰，是在RNA水平的干扰。效率分瞬转和稳转，瞬转的话，直接把小干扰分子投入培养液中，效率最高可达80%左右，效果很明显。稳转的话，就是通过慢病毒介导，实现稳定插入，这个效率最高也就60%不到。Cas9是最新的技术，作用都是实现特定位点的双链DNA断裂，然后引发自主损伤修复，从而造成基因序列的缺失，不过这种缺失是永久的，也是稳定的基因敲除，效率则是100%。4.引物设计5.载体构建