基因工程考试复习

2012级《基因工程》考试复习姓名：__________电话：___________一基因工程是指将一种或多种生物体(供体)的基因或基因组提取出来,或者人工合成的基因,按照人们的愿望,进行严密的设计,经过体外加工重组,通过一定的方法,转移到另一种生物体(受体)的细胞内,使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术.基因工程是指在体外将目的基因插入病毒、质粒或者其他载体分子中、构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原来没有这些基因的寄主细胞内，且能稳定的遗传。基因工程三要素：供体受体载体基因工程的操作步骤：切→接→转→检基因工程研究的内容：基因的分离与克隆转化体的筛选[书本]:（GE克隆载体的研究载体的选择与构建外源基因整合和表达的检测GE受体系统的研究基因转化受体系统的建立外源基因在细胞中的表达调控目的基因的研究基因转化技术外源基因的遗传GE工具酶的研究GE新技术的的研究）基因工程诞生的理论基础及技术基础1)理论基础20世纪40年代，确定了遗传信息的携带者是DNA而不是pro,从而明确了遗传物质的基础问题。50年代，DNA双链和DNA结构的双螺旋模型和DNA半保留复制机理解答了DNA的自我复制和遗传信息传递问题。50年代末和60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了基因遗传信息的流向和表达方式。2）技术基础限制性核酸内切酶的发现DNA连接酶的发现GE载体的发现转化（导入）方法基因表达6如何正确看待基因工程(正反两方面）虽然GE解决了生产生活中的一些问题，如：①红色GE:指的是医疗部门的GE，涉及的基因改造的细菌产生的基因药物如胰岛素。②白色GE:包括环境微生物学，环境技术和其他技术或工业应用。③绿色GE:在农业上的应用，用在作物育种的主要重点是植物的不敏感的害虫和疾病。但是基因工程的安全性引起了强烈的关注和质疑：问题1用于筛选的标记基因或报告基因是否会对人畜有害，同时导致病原菌抗药性的提高。问题2抗除草剂基因会不会使转基因植物变成不可控制的杂草，或漂移到杂草上使杂草泛滥。问题3外源基因插入的位置效应是否会引起有害的沉默基因的表达。问题4转基因动物是否会演变成对人类有极大威胁的新物种。问题5基因治疗是否对人体的正常功能产生不良影响。二DNA提取（基因组，质粒DNA，噬菌体）原核基因组DNA提取方法：苯酚氯仿抽提法。植物组织中DNA的提取CTAB的作用:CTAB[十六烷基三甲基溴化铵]是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液[0.7mol/LNaCl]中是可溶的，当降低盐溶液的浓度到一定程度[0.3mol/LNaCl]时从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与合算的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。动物组织中DNA的提取SDS的作用:溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对RNase、Dnase有一定的抑制作用；SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。载样缓冲液的作用①增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.质粒DNA提取的两种方法：氯化铯密度梯度离心法,利用碱变性法提取质粒DNA方法及原理）p91氯化铯-EtBr密度梯度离心法是根据“在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子质量的细菌染色体DNA易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子质量较小、结构紧密，仍能保持完整的状态”这种差别建立的纯化质粒DNA的技术。原理：当将含有溴化乙锭EtBr的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合大量的EtBr分子，直至达到饱和（每个碱基对大约结合一个溴化乙锭分子）。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子，由于在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入，EtBr分子的结合数量相对较少。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯中的浮力密度也有所不同。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越来越多，其密度也就越低。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同位置。取出DNA，用异丙醇抽提溴化乙锭，再用缓冲液透析除去残余氯化铯，最后用两倍体积冷乙醇沉淀，就得到了纯化的质粒DNA。碱变性法提取质粒DNA方法及原理碱变性法提取质粒DNA方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH12.0~12.5时，线性的DNA会完全变性分开，甚至出现断裂；而共价闭合环状质粒DNA虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开。通过冷却或恢复中性pH使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，在离心时，大部分主染色体与细胞碎片、杂质等缠绕在一起被沉淀，通过离心即可除去线性染色体，而可溶性的cccDNA留在上清液中，将含有cccDNA的上清液用乙醇沉淀，获得质粒DNA。DNA样品浓度的测定方法a,在琼脂凝胶上用荧光染料进行标准比对。b，利用分光光度计测吸收值。A260.DNAConcentration（浓度）MeasurementComparisonwithastandardusingafluorescingdye（荧光染料）onanagarose-gel琼脂糖胶凝.UsingabsorptionofDNAinaUV-spectrophotometer分光光度计DNA纯度的测定DNA在260纳米处有最大吸收峰，但蛋白质核酸的主要污染源在280nm处有最大吸收峰，A260/A280适合纯度测定。纯DNA=A260/A280=1.8纯RNA=A260/A280=2.0低于1.8含苯酚或蛋白质，高于1.8含RNA和单核苷酸。DNA纯化的方法：a氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法（CsCl-EB）适合纯化大剂量DNA。b阴离子交换层析法c琼脂糖凝胶电泳洗脱法，适合小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收纯化。d基因纯试剂盒核酸杂交类型：A转移印迹southren杂交：检测DNANorthren杂交：检测RNAWestern杂交：检测蛋白质B点印迹、狭缝印迹[dotblotting/slotblotting]C原位杂交[insituhybridization]质粒特性：1什么叫质粒一类存在于细菌或真核细胞中，独立于染色体之外能自主复制的裸露的双连环状（少数为线状和RNA）DNA分子，是与细菌或真核细胞共生的遗传成分。2质粒的构型，及不同构型的大小迁移顺序绝大多数质粒是环状双链，其分子具有3种不同的构型：1）当其两条多核苷酸链均保持着完整的环状构型时，成为共价闭合环形DNA，即cccDNA。这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型。2）如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环状结构，另一条出现一至数个缺口时，称为开环DNA（ocDNA），此即OC构型。3）若质粒DNA经过适当的限制酶切割后，发生双链断裂而成线性分子（L-DNA)，通称L构型。在正常的电泳条件下，不同构型的质粒DNA，尽管分子质量相同，但是仍然具有不同的电泳迁移率，其大小顺序为：cccDNA(scDNA)L-DNA(线性DNA）OC-DNAD-DNA(二聚体DNA）T-DNA（三聚体DNA）。经过合适的限制酶处理后所有结构的DNA都转化为线性分子。3质粒的大小差异大，最小的不到1kb,最大的甚至超过500kb。4宿主细胞在标准培养条件下，一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。5理论上讲，几乎所有的细菌都含有质粒。几乎所有的质粒都会带有一个至多个基因，而这些基因的表达常常赋予细胞有用的特性。6质粒DNA都含DNA的复制起始点，这使得质粒可在宿主细胞中独立复制，分子质量小一点的DNA可利用宿主细胞中的DNA复制酶来进行自身的DNA复制；分子质量大一点的DNA本身含有DNA复制时所用酶的基因，质粒DNA复制时所用的DNA复制酶是自身DNA基因表达的产物，还有一些质粒DNA能将自身的DNA插入到寄主细胞染色体上，随寄主染色体复制而复制。常用电泳缓冲液种类及特点TAE50×242gTris57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)双链DNA分子的泳动速率比另两者快10%，超螺旋在其中电泳时更符合实际分子质量，回收DNA片段时首选，大片段分离效果好，缓冲容量小，过夜电泳不可选用。TBE5×54gTris27.5硼酸20mol0.5mol/LEDTApH8.0小片段（＜1kb）分离效果好，回收率差，不宜用于回收电泳。缓冲容量大，过夜电泳适合TPE10×108gTris15.5ml磷酸（85%，1.679g/ml)40ml0.5mol/LEDTApH8.0磷酸盐的浓度偏高，容易使DNA沉淀，也不适合回收电泳，缓冲容量大，过夜电泳适合电泳缓冲液组成及其作用类型6×缓冲液储存温度I0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰FF40%蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝室温0.25%二甲苯氰FF15%聚蔗糖水溶液III0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液作用：增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔中；在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳速度和位置；使样品呈色，使加样操作更方便。DNA沉淀两种方法的优缺点1乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。2异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离物质原理（三个效应）不连续电泳凝胶采用两层或3层性质不同的凝胶（样品胶，浓缩胶和分离胶）重叠起来会用，前两种胶的缓冲液、PH和孔径大小完全一样，不同的是浓缩胶中无样品。分离胶的孔径较小，PH也不同，能使能读较低的各组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率。第一三个不连续：凝胶孔径的不连续缓冲液离子组成及各层凝胶ph的不连续在电场中形成的电位梯度的不连续第二不连续系统中的三种物理效应电荷效应酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电荷作用下向一定的电极及一定的速度移动。分子筛效应相对分子质量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，所受摩擦不同，受阻程度不同，表现出不同的迁移率浓缩效应使待分开样品中的各组分在浓缩胶中被压缩成层。基因的化学合成：人工合成的短DNA片段5’末端为OH，而天然的DNA5’末端为—P.（磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法）基因组装方法：①全片段酶促链接法：带上必要的5’磷酸基团，与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，加入T4DNA连接酶，使它们彼此连接组装成一个完整的基因或基因片段，这些组装的产物插入到适当的载体上，转化受体细胞，最后用DNA序列分析检测所组装的基因。例如：α—干扰素和牛视紫红质基团。②酶促填充法：将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，产生的单链区断在加入的klenow酶的聚合作用下合成互补链，再和载体连接。PCR组成成分，标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR引物设计原则PrimerDesign:①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②引物不能形成二级结构。③引物长度一般在15~30碱基之间。④G+C含量在40%~60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有