基因工程试验(综合)

实验一大肠杆菌基因组DNA提取与检测一、目的要求1．学习并掌握用试剂盒提取细菌基因组DNA；2.学习使用分光光度计检测基因组DNA浓度二、基本原理本实验利用TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA。该试剂盒采用了溶菌酶裂解细胞，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，然后使用特殊的相分离法除去蛋白质、多糖、脂质等杂质，再结合DNA制备膜技术纯化细菌基因组DNA。三、实验材料1.实验菌株：大肠杆菌TG12.实验试剂：LB液体培养基TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0试剂盒无水乙醇3.实验仪器：移液枪，低温离心机，水浴锅，eppedorf管，振荡器四、操作步骤1.大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4ml的液体培养基中过夜培养。2.取1～4ml的过夜培养菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清。3.用150μl的SPBuffer（含RNaseA1）充分悬浮细菌沉淀。注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。4.加入20μl的Lysozyme溶液，均匀混合后室温静置5分钟。5.加入30μl的EDTABuffer，均匀混合后室温静置5分钟。6.加入200μl的SolutionA，剧烈振荡后65℃保温10分钟。注）①若SolutionA出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。②65℃保温10分钟后，溶液将由乳浊液变成透明液。如果此时溶液没有变成透明，说明细菌没有裂解，基因组DNA将不能释放。7.加入400μl的SolutionB，剧烈振荡15秒。注）若SolutionB出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。8.加入650μl的SolutionC，上下颠倒均匀混合。9.12,000rpm离心1分钟。10.先弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）移入预先置于1.5ml离心管上的FilterCup中，12,000rpm离心1分钟。注）有机相（上层）请务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上。11.弃FilterCup，在滤液中加入450μl的DBBuffer，混合均匀。12.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。13.将上述操作11的混合液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。14.将500μl的RinseA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。15.将700μl的RinseB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。注）请确认RinseB中已经加入了指定体积的100%乙醇。请沿SpinColumn管壁四周加入RinseB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。16.重复操作步骤15。17.将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心1分钟。18.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。注）把水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。19.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。20.取5μlDNA洗脱液用琼脂糖电泳进行检测20.取10μlDNA洗脱液用分光光度计检测其浓度及纯度，其余-20℃保存实验二基于16SrRNA基因的PCR扩增、电泳和胶回收一、实验目的1.了解PCR扩增DNA的技术及原理；2.学习PCR扩增仪的使用；3.学习琼脂糖凝胶的制备和电泳方法；4.了解DNA胶回收的原理及方法。二、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，16SrDNA基因同源性分析是一种常用的细菌分子鉴定方法。细菌中包括三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16SrDNA是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA的基因，长度为1540bp，相比较5SrRNA和23SrRNA而言，长度适中，又具有保守性和存在的普遍性，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，因此，现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对细菌进行测序分析。16SrDNA鉴定是利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA的提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤，是一种快速获得细菌种属信息的方法。聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是在引物指导下由酶催化的对特定模板的扩增反应，是一种体外DNA扩增技术。PCR的工作原理（图1）类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA。PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95℃，复性温度为37℃～55℃，延伸合成温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），反应循环数为30。图1PCR反应原理PCR是否成功，需要利用琼脂糖电泳进行检测。琼脂糖电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。PCR后往往有非特异条带出现，为了获得专一的目的条带，所要对PCR产物进行切胶回收。胶回收是利用特殊硅基质材料在高盐、低pH值情况下吸附DNA，在低盐、高pH值情况下释放DNA的原理纯化获得目标DNA。DNA胶回收后同样需要利用电泳进行检测。三、实验材料1、实验器材PCR扩增仪，台式高速离心机，移液器，灭菌后的PCR管，电泳仪，凝胶成像仪等。2、实验试剂（1）模板DNA（0.1µg/µl）。（2）TaqDNA聚合酶（5U/µl），10×扩增缓冲液，dNTP（1mmol/l）（3）引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和518R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）（20µmol/l）（4）TAE缓冲液（50×）（pH8.0）：每升溶液中含有242gTris，57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/lEDTA。电泳时稀释成1×浓度使用。（5）溴酚兰-甘油指示剂：先配制0.1%溴酚兰水溶液，然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成。（6）0.5μg/ml溴乙啶染液：称取5mg溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml，取1ml此溶液用1×TAE缓冲液稀释到1升，最终浓度为0.5μg/ml。（7）琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根，中国）四、实验步骤1、准备PCR反应溶液（1）按以下次序，将下列成分在0.5ml灭菌Eppendorf管内混合：模板DNA1µl10×扩增缓冲液5µl4×dNTPs(包括四种dNTP,100µmol/l)1µl27F1µl518R1µlTaqDNA聚合酶1µl(2.5U)加水至终体积50µl（2）用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。（3）加石蜡油10µl封住溶液表面。2、PCR扩增反应将混有菌体的PCR管置于PCR扩增仪内，95℃5分钟，使模板DNA完全变性。然后按95℃变性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸2分钟，重复循环30次，循环结束后72℃延伸10分钟。反应完毕，将样品取出置-4℃待用。3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳（1）制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65℃时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。在室温放置0.5～1h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。（2）加样：取5µlPCR产物，加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂，混匀后小心地加到样品槽中。同时另取一个已知分子量的标准DNA水解液，在同一凝胶板上进行电泳。（3）电泳：维持恒压100V，电泳0.5～1h，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。（4）染色：将凝胶取出后浸入0.5mg/ml溴乙啶溶液中，染色0.5～1h。染液可反复多次使用。（5）观察：将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察，DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。4、PCR产物胶回收使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。（1）柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）（2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。（3）向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100µl，则加入100µlPN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。注意：对于回收300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。（4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：吸附柱容积为800μl，若样品体积大于800μl可分批加入。（5）向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5min再离心。（6）重复操作步骤5。（7）将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。（8）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。注意：洗脱体积不应小于3