基因工程重点

1．什么是基因工程？是指在基因水平上操作并改变生物遗传特性的技术，也称为DNA重组技术2．转基因育种的实质是什么？即基因工程，就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体3.基因工程研究的内容是什么？（1）分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源（2）大规模生产生物活性物质（3）设计、构建生物的新形状甚至新物种（4）目的基因的研究（5）生物基因组学的研究4.基因工程研究意义：通过基因工程的研究和开发，对人类生活质量的全面改善，健康水平的全面提高，人类赖以生存环境根本上的优化具有重要的作用和深远的意义前景：(1)改善农业生产，解决食品短缺：①提高农作物的产量及品质②发展畜牧业生产(2)提高生命质量，延长人类寿命：①开发新型药品②疾病的预防和诊治③基因治疗④人类基因组计划(3)解决能源危机、治理环境污染：①解决能源危机②保护环境(4)生化武器第二章工具酶习题1.粘性末端：经限制性内切核酸酶酶切后，DNA片段末端的一条链多出1至几个核苷酸，可与另一DNA片段互补核苷酸末端黏结，这样的DNA片段末端称为黏性末端2.同尾酶：一些识别序列不同，但酶切DNA分子所得的DNA片段具有相同的黏性末端的限制性核酸内切酶3.同裂酶：一些来源不同，但具有相同的识别序列的限制性核酸内切酶4.星号活性：某些限制性内切核酸酶在特定的条件下，可以在不是原来的识别序列处酶切DNA的现象。5.klenow片段：DNA聚合酶I被枯草杆菌蛋白酶分解后，分子质量为76kDa，具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切核酸酶活性的一个片段6.限制性内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。7.外切酶：一类能从DNA或RNA链的一端开始按序列催化水解3’，5’-磷酸二酯键，产生单核苷酸的核酸酶。8.DNA连接酶：能使磷酸二酯键断裂的DNA链重新形成磷酸二酯键而再接合在一起的酶9.蛋白酶：水解蛋白质肽链的一类酶。10.部分酶切:限制酶处理DNA时因酶量或反应时间不足，以致DNA靶位点只有一部分被裂解。11．RFLP：基因型之间限制性片段的差异。12.限制修饰系统：是一种存在于细菌或是其他原核生物，保护个体免于外来DNA如噬菌体侵入的系统，主要是由限制性内切酶和甲基化酶组成的二元系统13.切口平移：切口产生3'羟基和5'磷酸基团，DNA延伸合成3'端，5'端被小片段降解，缺口位点沿着双链向3'端移动。14.试列举5种不同的基因工程工具酶，说明该酶在基因工程操作中的应用。（1）限制性内切核酸酶：识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：催化毗邻的一条DNA链的5’-P与另一条DNA链的3’-OH之间形成磷酸二酯键，使断裂的DNA重新结合（3）DNA聚合酶：以DNA为模板，以4种脱氧核糖核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链（4）RNA聚合酶：以DNA或RNA为模板，以4种三磷酸核苷为底物催化合成RNA（5）细胞裂解酶：在制备DNA和RNA时，裂解细胞壁15.如何在体外重组中防止DNA的自身连接？（1）利用碱性磷酸梅处理线性载体分子（2）使用同尾酶产生的粘性末端连接方法（3）利用同聚物加尾连接技术（4）应用柯斯质粒载体16．体外重组及其的形式有哪些？体外重组：在体外对生物的遗传物质或人工合成的基因进行改造或重新组合形成新核酸分子或新基因的手段。形式：①粘性末端连接②平末端DNA分子间的链接③同聚物加尾法第三章核酸提取及检测1.CCC-DNA：共价闭合环状DNA2.DNA变性：核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核算的天然构象和性质发生改变。5.DNA复性：在适宜条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象。6.PCR：即聚合酶链式反应，是模仿细胞内发生的DNA复制过程，在体外由酶催化合成特异性DNA片段的的反应。7.模板：3’端具有与引物杂交的序列的一条单链DNA片段8.引物：在PCR过程中引导互补链DNA合成的一种脱氧核苷酸寡聚体9.PCR的平台效应：PCR过程经过一定次数的循环后，待扩增的DNA片段不再以指数关系继续累积，而是以线性关系累积或停止累积的现象。10.热启动Taq酶必需经过高温才能激活的高特异taq酶。11.引物二聚体的产生和防止引物的3’端间相互错配扩增而形成的原因：（1）引物设计的的问题（2）PCR体系反应条件的问题（3）退火温度的问题（4）扩增次数的问题防止：（1）适当增加循环次数（2）适当提高退火温度（3）配制的PCR体系要混合均匀（4）适当增加模板量（5）重新合理设计引物12.试说明CTAB、SDS、proteaseK、异硫氰酸胍在破碎细胞时的作用。（1）SDS:用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸，在较高温下破坏蛋白质与DNA结合，使DNA释放出来（2）proteaseK：有效降解细胞裂解物中的DNA酶和RNA酶（3）CTAB：裂解细胞壁（膜），与DNA形成复合物易溶于高盐溶液（4）异硫氰酸胍(GuSCN)：使蛋白变性，细胞裂解13.酚仿试剂的三种成分在DNA分离中的作用是什么？（1）苯酚：是蛋白质变性剂，同时可抑制DNA酶的降解作用（2）氯仿：除脂，使蛋白质变性（3）异戊醇：减少操作过程中气泡的产生。14.PCR引物设计的原则有哪些？①引物长度在15-30bp，Tm接近72℃较佳②引物中碱基的分布应当是随机的避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构③GC碱基的含量在45%-55%④两个引物在3’端均必须与模板互补，5’端可以不互补⑤引物自身连续互补碱基小于4个⑥引物之间连续互补碱基亦应小于4个15.试举出5中不同形式的PCR，说明各自的原理及应用。（1）反转录PCR原理：在RNA反转录反应基础上进行PCR扩增应用：检测单个细胞或少数细胞内低丰度特异性的RNA（2）套式引物PCR原理：先后用外内两对引物扩增低拷贝数DNA片段应用：提高DNA片段扩增的敏感性和特异性（3）反向PCR原理：用与靶DNA两侧已知序列互补的反向引物来扩增两引物以外的未知DNA序列应用：用于对基因游走、转位基因等的分析研究（4）芯片PCR原理：在芯片上进行PCR扩增应用：生物医学领域，及各种基因重拍、基因突变、基因缺失的鉴定（5）免疫PCR原理：以常规标记免疫技术为基础进行PCR扩增应用：抗原检测16.试述琼脂糖凝胶电泳的原理及应用。（1）原理：是用琼脂糖制备的凝胶的电泳。用0.8%琼脂糖凝胶置于0.5×TBE电泳缓冲液中电泳，由于3种构型DNA的迁移率不同，ccc-DNA最快，1-DNA其次，oc-DNA最慢，电泳结束后，同一质粒在凝胶板上出现3条带。（2）应用：主要用于检测DNA分子，可检测70bp至80pb长度的双链DNA片段第四章基因克隆载体1．载体：能携带外源DNA片段或基因进入受体细胞，并使其在受体细胞中得以维持或表达的一种具有特定功能的DNA分子2.穿梭载体：指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制3.cosmid：柯斯质粒，由质粒和含有cos位点的小λDNA片段组装而成的一类新克隆载体4.Plasmid：即质粒，存在于细胞内染色体之外的双链DNA分子5.酵母人工染色体（YAC）：将酵母染色体DNA的端粒、DNA复制起点和着丝粒及必要的选择标记基因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中获得的重组质粒6.三亲本杂交：由于所用供体质粒PHNC3中不含转移基因tra，所以该结合转移必须有含tra基因的辅助菌株E-coli（PKR20B）参加完成，因此该结合转移过程为三亲本杂交。8.蓝白斑筛选：一种基因工程常用的细菌重组质粒的筛选方法9双亲本杂交：质粒是接合型质粒的两种亲本杂交方式13.选择性标记基因及种类（1）生物，尤其微生物中，为得到遗传的重组体而用于直接进行选择的基因（2）种类：①颜色标记基因②抗性基因14.载体的基本要求有哪些？（1）针对受体细胞的可转移性（2）自主复制功能（3）显著的帅选标记（4）特定的多克隆位点（5）安全性15.E.coli质粒载体类型以及构建策略如何？（1）类型：①融合型蛋白表达载体②非融合型蛋白表达载体③分泌型表达载体（2）策略：①能在受体细胞中进行有效复制，并有较多的拷贝数②含有外源DNA片段克隆位点。且克隆位点越多越好③含有供选择克隆子的标记基因④载体DNA分子应尽可能的小⑤构建不同用途的质粒载体时，根据需要组装各种元件16.简述各类载体（细菌、植物、动物、人工染色体）的概况及应用。（1）常见的原核生物克隆载体包括质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体。主要用于克隆外源目的基因、构建基因文库等（2）植物基因克隆载体主要有Ti质粒载体和CaMV、TMV等病毒基因载体。主要用于建立植物细胞的外源基因表达体系、表达外源基因等。（3）动物基因克隆载体主要有SV40载体、反转录病毒载体、腺病毒载体、痘苗病毒载体、杆状病毒载体等。主要用于表达外源基因、肿瘤的基因治疗、真核基因的表达及疫苗的研发生产等（4）人工染色体载体主要有酵母人工染色体载体（YAC）、细菌人工染色体载体(BAC)和P1人工染色体载体(PAC)。主要用于真核生物基因组文库的构建及真核基因的克隆、表达等研究等第五章目的基因的分离和修饰1．酵母双杂交系统：用于检测细胞内蛋白质相互作用的遗传系统2.噬菌体展示技术;是一种基因表达筛选技术，即指将目的基因导入特定载体上，使其表达产物在噬菌体表面，而后根据表达产物的某些生物活性的检测来帅选、富集这种带目的基因的噬菌体的技术4.染色体步查：是一种利用已知的基因或DNA分子标记来分离与其紧密连锁的未知基因的有效方法6.基因组文库：指贮存了某种生物全部基因信息的一个受体菌全体7.cDNA文库：某种生物材料的基因转录产物mRNA经反转录形成不同的cDNA片段，与克隆载体重组后贮存在受体菌群体中，这样的群体就称为cDNA基因文库8.DNA改组：基因的体外同源重组14.什么是DNA诱变？包括哪些类型？（1）是指对克隆化基因进行诱变处理，改变其核酸序列以获得突变基因，用来研究基因结构和功能的过程（2）随机诱变和定点诱变随机诱变：①化学诱变②盒式诱变③嵌套缺失诱变④易错PCR诱变定点诱变：①PCR介导的定点诱变②寡核苷酸介导的定点诱变16.基因文库筛选的方法有哪些？基因文库帅选：从基因文库中确定目的基因克隆子的过程（1）制备核酸探针进行杂交筛选（2）制备抗体进行免疫杂交筛选（3）根据生物大分子间的相互作用筛选目的基因（4）利用PCR技术筛选基因文库（5）利用噬菌体表面显示技术分离目的cDNA克隆（6）利用酵母双杂交系统分离目的cDNA克隆第六章重组基因导入受体细胞1．受体细胞：即宿主细胞，技术上指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞，目的上指有应用价值和理论研究价值的细胞2.转化(transformation)：指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持与表达的过程3.感受态细胞：指处于能吸收周围环境DNA分子的生理环境的细胞4.转化率：DNA分子转化受体菌获得转化子的效率5.转导(transduction)：指通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程6.转染（transfection）:指采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程6.报告基因:一种编码可易于鉴定的蛋白质和酶的基因8.分子探针:指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的DNA分子、RNA分子和蛋白质分子9.分子杂交:指不完全互补的两条核苷酸链在适宜条件下，按碱基互补配对原则形成双链的过程10.重组子:含有重组DNA分子的转化子11.转化子：导入外源DNA后能稳定存在的受体细胞12、简述CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞并转化重组DNA的原理和过程。（1）原理：体外连接的DNA分子导入合适的受体细胞