基因抑制技术

基因敲除：是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。RNA干扰是与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。RNA干扰技术的原理和应用马鹏鹏薛社普韩代书(中国医学科学院基础医学研究所,中国协和医科大学基础医学院细胞生物学系,北京100005)RNAi是由双链RNA所引起的序列特异性基因沉默。RNAi首先由Fire等发现于秀丽隐杆线虫(C.elegans)中,他们发现将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达,并证实这种抑制主要作用于转录之后,所以又称RNAi为转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)。随后人们陆续在果蝇(Drosophila)、锥虫(Trypanosomes)、涡虫(Planaria)、斑马鱼(Zebrafish)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、大小鼠和人体内发现了RNAi现象,遗传学研究表明RNAi是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制,与真核细胞中许多重要生物学过程密切相通过对RNAi现象的遗传学与生物化学研究,其作用机制已日渐清晰(见图1)。Zamore等利用果蝇胚胎提取物建立的体外系统,证实RNAi是一个依赖ATP的过程,在此过程中,dsRNA(外源的或体内产生的)首先被降解为具52单磷酸、长21～23bp的小分子双链RNA,这种RNA分子称为小干扰RNA,siRNA通过碱基互补配对识别具同源序列的mRNA,并介导其降解。研究表明在生物体中siRNA具相似的结构特征:为长约21～23bp的双链RNA,具5单磷酸和3羟基末端,互补双链的3端均有一个2～3nt的单链突出。在RNAi过程中一种称为Dicer的核酸酶负责将dsRNA转化为siRNA,它属于RNaseⅢ家族,具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域,Dicer在催化过程中以二聚体的形式出现,其催化结构域在dsRNA上反平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约22bp的距离切断dsRNA,各种生物体内Dicer结构略有不同,致使siRNA长度存在微小差别。siRNA形成之后,与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体(siRNAinducedinterferencecomplex,RISC),此复合物通过碱基互补配对识别靶mRNA并使其降解,从而导致特定基因沉默。在RISC中,起靶序列识别作用的是siRNA的反义链,Zamore等发现在RNAi过程中,首先产生的是RISC无活性前体,分子量～250kD,当加入ATP后可形成100kD的活性复合体。由无活性前体向活性酶复合物的转换类似蛋白酶原的激要求结合于其上的siRNA双链的解开。在ATP存在时,依赖于ATP的解旋酶解开siRNA的双链并将其正义链与靶mRNA置换,mRNA取代正义链与反义链互补,然后由活化的RISC在互补区的中间,距离siRNA反义链3末端约12bp处切断靶mRNA序列。RNAi效应具有两个明显的特征,特异性和高效性。干扰的高效性提示在机制中存在信号放大的步骤。Fire等早在1998年便发现少量的dsRNA就能够导致线虫大量的靶mRNA降解,但单凭少量dsRNA被Dicer降解为几十个siRNA并不能解释这种高效性。许多研究显示RNAi过程中有新的dsRNA分子的合成,当siRNA反义链识别并结合靶mRNA后,siRNA反义链可作为引物,以靶mRNA为模板在依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA2dependentRNApolymerase,RdRP)催化下合成新的dsRNA,然后由Dicer切割产生新的siRNA,新siRNA再去识别新一组mRNA,又产生新的siRNA,经过若干次合成切割循环,沉默信号就会不断放大(图1)。正是这种称为靶序列指导的扩增(target2directedamplification)机制赋予了RNAi的高效性和持久性。四大基因沉默技术是什么？基因敲除共抑制反义RNARNAi仅供参考