鸡粪好氧发酵高效同程硝化-反硝化菌筛选及其生物学特性研究-

中国农业大学学报!!#!$%&#$?%’?)*+,-./*0123-.45,36+/7+,./8-39:,;37鸡粪好氧发酵高效同程硝化&反硝化菌筛选及其生物学特性研究曹立群!喻其林!肖维伟!孙文!顾文杰!王立群东北农业大学生命科学学院!哈尔滨$&%#摘!要!为验证鸡粪好氧发酵过程同程硝化’反硝化细菌的存在全程进行了高效同程硝化’反硝化菌株的分离%筛选并对筛选的高效菌株进行鉴定和生物学特性研究#筛选到$株高效同程硝化’反硝化细菌)a(&’!鉴定为假单胞菌!/97-&8&#+/;U=为兼性化能自养型菌株#)a(&’!菌株生物学特性为$当有机物质量浓度$%?G5!H%氨态氮质量浓度!$!G5!H%UX#%1!F为%I&(和培养温度(&f时氨态氮利用效率最高#)a(&’!菌株的有机物耐受范围宽有机物质量浓度为?#$!(G5!H时作用%S后的氨态氮利用率可达%[以上#在鸡粪好氧发酵过程中分离%筛选到$株高效同程硝化’反硝化细菌证明了该固态发酵体系中存在同程硝化’反硝化细菌#关键词!鸡粪(发酵(硝化(假单胞菌中图分类号!K$($I%!!!文章编号!$L’(%%%!##&’?%’L!!!文献标志码!4C(A@&-LL-,/(N-3(2+5/6)-.+3)(/(L1()A&*-)(/(L1()A46,/-(63,--)()A(),.2K.3/()A.L,@(,J-)26)+-6)*/@-(,@66,/-(3/(,3H9DB(&R+)!;=W(&5()!:9DP-(&G-(!=7P-)!M=P-)&X(-!P97MB(&R+)#$%%&’&$(C,(&@2,&-2&8!L$+*3&.8*4’+,25%*5+.%6-,7&+8,*/!B.+K,-!Q;;=;!#3,-.#943/6,/!P-$+1&+*$7&+,(/*3&&N,8*&-2&$(8,?5%*.-&$58-,*+,(/,-’J1&-,*+,(/,-’,-2$?H$8*,-’$(23,2V&-?.-5+&!3,’3J&((&2*,7&8,?5%*.-&$58-,*+,(/,-’J1&-,*+,(/,-’K.2*&+,.M&+&,8$%.*&1.-182+&&-&1A3&K.2*&+,.M&+&*3&-,1&-*,(,&1.-1*3&,+K,$%$’,2.%23.+.2*&+,8*,28M&+&8*51,&1A3&+&85%*883$M&1*3.*.3,’3J&((&2*,7&8,?5%*.-&$58-,*+,(/,-’J1&-,*+,(/,-’8*+.,-cgRQJ!K&%$-’,-’*$(.25%*.*,7&.5*$*+$H3!M.882+&&-&1.-1,1&-*,(,&1.8I8&51$?$-.88HP*85*,%,Y.*,$-+.*&*$.??$-,5?-,*+$’&-+&.23&1*3&?.N,?5?,-($%%$M,-’2$-1,*,$-8$2$-2&-*+.*,$-$($+’.-,22$?H$5-18,-!=G;?’&C!2$-2&-*+.*,$-$(.??$-,5?-,*+$’&-,-!?’&C!HBT!#&L=QR!.-125%*5+&*&?H&+.*5+&.*RQfA3&8*+.,-3.1.M,1&+.-’&$(*$%&+.-2&*$$+’.-,22$?H$5-18!.-1,*85*,%,Y.*,$-+.*&*$.??$-,5?-,*+$’&-M.8.K$7&=;aM3&-2$-2&-*+.*,$-$($+’.-,22$?H$5-1823.-’&1(+$?GT;?’&C*$;R;?’&CA3&8*51/7&+,(,&1*3&&N,8*&-2&$(8,?5%*.-&$58-,*+,(/,-’J1&-,*+,(/,-’,-*3,82$?H$8*,-’8/8*&?F-1G.*3!23,2V&-?.-5+&%2$?H$8*,-’%-,*+,(,2.*,$-%I8&51$?$-.88H收稿日期$!#’&’!(基金项目$国家自然科学基金资助项目1!%&#作者简介$曹立群!硕士研究生%王立群!教授!通讯作者!主要从事微生物学研究!P’G.3/$_.-5/3l+-!$?%=6*G!!硝化’反硝化作用是自然界氮素循环的重要环节*传统观念认为好氧细菌进行硝化作用!厌氧细菌进行反硝化作用%因好氧’厌氧条件的不同!使这两类菌的硝化’反硝化作用不能同时进行*近年来国内外研究发现!一些好氧细菌也能完成反硝化($’%)*由此使得好氧条件下同程硝化’反硝化的作用日益受到重视!并在污水生物处理系统中屡见同程硝化’反硝化;3G+/7.-:*+;-37,303-5’S:-37,30’3-5!KFN#现象!具体在生物转盘(()’KMY(&)’氧化沟(?)和14KD等方式的污水处理工艺(L)中均有报道*!!由于同程硝化’反硝化细菌能够在同一菌体内将氨态氮转化为无害的F!!若将这类细菌应用于人工生物脱氮环节!可提高脱氮效率!对于遏制日趋严重的水体富营养化等氮素污染现象具有重要作用*但是!目前人们所发现的同程硝化’反硝化细菌为数中国农业大学学报!#年第$%卷!不多!主要有粪产碱菌*1;+1%9#9;+1%/;U=#(#)’脱氮副球菌!+(+;&;;7/-9#%’(%A%;+#/;U=#()和赤红红球菌@0&-&;&;;7/(7,9(#($)等!它们大多来源于污水生物处理工艺*至于其他固态物质环境的氮素转化中是否存在同程硝化’反硝化细菌!目前未见报道*!!同程硝化’反硝化细菌的筛选!主要是以氧化氨态氮时有无亚硝态氮’硝态氮生成及其生成量作为前提!此外还有用总氮变化量测定或氮素轨迹跟踪等方法进行验证的($’$%)*其中利用总氮测定法验证同程硝化’反硝化菌!因操作简便!得到较多的应用*!!鸡粪好氧发酵是一氮素含量相对较高’且转化活跃的环境!具备了同程硝化’反硝化细菌存在的条件*本研究从鸡粪好氧发酵环境入手!通过相应的分离’筛选等方法!旨在了解这一特定高氮素含量的固体环境是否存在同程硝化’反硝化细菌!探讨其生物学特性并明确微生物类别!尚可为人工生物脱氮所借鉴*#!材料和方法#*#!实验材料#=#=#!鸡粪!取自哈尔滨市幸福种鸡场的新鲜鸡粪%调理剂$鲜黄玉米秸秆!加工成&$$6G碎段*按堆肥8碳#&8氮#1&F#!&k$!含水率?&[($()!调整原料与调理剂的质量配比为$8鸡粪#k8玉米秸秆#k8水#g$k$I?k!I$*#=#=’!培养基!异养硝化细菌分离培养基$乙酰胺!5!F.]X$I?5!OX!E](#I!5!W5K](,LX!]I&5!O1/I&5!1+K](,&X!]I&G5!1.K](,!X!]I&G5!c-K](,LX!]I&G5!B:1/%,?X!]I&G5!琼脂$&$!5!无氨水三蒸水#$H!UXLI!$!$f蒸汽灭菌$&$!G3-($&)!制成平板备用*!!异养硝化细菌筛选培养基$硫酸铵I&5!琥珀酸钠!I$L5!维氏盐溶液&GH!无氨水三蒸水#水$H!UXLI!$!$f蒸汽灭菌$&$!G3-*!!好氧反硝化细菌培养基$酒石酸钾钠!5!OF]%!5!O!XE](I&5!W5K](,LX!]I!5!无氨水三蒸水#定容至$H!$!$f蒸汽灭菌$&$!G3-($?)*#D#D+!仪器!好氧发酵装置$自制!由保温箱体’温度检测及记录仪’气体控制及检测仪等%部分组成%福斯特,卡托!$型凯氏定氮仪%8’$&型紫外分光光度计%L!$型可见分光光度计*#D’!实验方法#D’D#!发酵及取样!!$#发酵方法*按堆肥1&F和水分含量要求取鸡粪’玉米秸秆及水!均匀混合装箱!密闭高温静态强制通风式发酵*发酵过程间断通风供氧!使物料内氧浓度不低于#G5&H!当堆体温度升至?&f时自动通风散热*在物料温度首次降至(&f时翻堆!补充失去的水分!继续使温度升高发酵!整个发酵过程高温期累加在#S以上*待物料温度再次降至室温’并维持(S后!结束发酵*发酵全程持续时间共计$#S*平行发酵试验做%组重复*!!!#取样方法*发酵过程按温度每变化$f取样$次%翻堆后的升温过程不再取样!待温度!次降至(&f后恢复取样!直至室温*室温维持阶段每!S取样$次*#D’D’!异养硝化细菌的分离!用异养硝化细菌分离培养基!按取样温度做菌落计数!同时依菌落形态和染色特征分离数量优势菌株!纯化’保藏备用*#D’D+!高效异养硝化菌株的筛选!上述保藏菌株!接种异养硝化细菌筛选培养基!按菌株分离温度’以$%,&G3-摇床好氧培养%S*之后取样!以氯化钾浸提’氧化镁蒸馏法($L)测定培养基中的终止氨态氮浓度!计算菌株氨态氮利用率*并对所得数值作统计学的方差分析*将氨态氮利用率高’且方差分析差异显著的菌株!定为高效菌株*氨态氮利用率g(初始氨态氮浓度i终止氨态氮浓度#&初始氨态氮浓度)Z$[*在此基础上!仅就高效菌株所在培养基取样!分别以F’$’萘基#’乙二胺光度法($&)和紫外分光光度法($#)测定其中生成亚硝态氮和硝态氮的浓度!同时采用碱性过硫酸钾’紫外分光光度法($&)对总氮进行测定*为后续验证高效菌株的同程硝化’反硝化作用作铺垫*#D’D,!高效同程硝化’反硝化菌株的筛选!将高效异养硝化菌株接种好氧反硝化培养基!按菌株分离温度!以$%,&G3-摇床好氧培养%S*之后取样!以$I!I%节中方法测定培养基内终止硝态氮浓度!计算菌株的硝态氮利用率*选择硝化及反硝化能力俱优的为高效同程硝化’反硝化菌株*硝态氮利用率g(初始硝态氮浓度i终止硝态氮浓度#&初始硝态氮浓度)Z$[*因高效同程硝化’反硝化菌株在环保领域具有很高的实用性!故对其进行进一步研究*(?!第&期曹立群等$鸡粪好氧发酵高效同程硝化’反硝化菌筛选及其生物学特性研究#D’D-!高效同程硝化’反硝化菌株的鉴定!参照3伯杰氏细菌鉴定手册4($)!依据形态和生理生化特征对高效同程硝化’反硝化菌株进行微生物学鉴定*#D’D%!高效同程硝化’反硝化菌株的生物学特性!调整异养硝化细菌筛选培养基的有机物浓度’氨态氮浓度’UX’1&F’空气体积分数密闭容器内加入物料后!所剩空间与容器总空间之比#及培养温度等条件!将高效同程硝化’反硝化菌株分别接种上述各条件培养基!除培养温度条件外!所试各条件均以分离温度于$%,&G3-的摇床好氧培养*%S后!检测所试各环境条件对高效同程硝化’反硝化菌株氨态氮利用率及生成亚硝态氮和硝态氮浓度的影响*其中氨态氮浓度’亚硝态氮浓度及硝态氮浓度测定见$I!I%节*’!结果与分析’D#!异养硝化菌株的分离及其高效菌株的筛选!!在鸡粪好氧发酵各温段共分离到$Ka!&’$$Ka&&’!及)a&&’$$)a%&’%异养硝化细菌$L株*各菌株的名称$K为升温!)为降温!a为硝化!数字为温度*!!图$为分离获得的$L株异养硝化细菌在筛选培养基中的氨态氮利用率和方差分析结果*从中可见Ka%&’$’)a%&’%和)a(&’!菌株的氨态氮利用率均较其他$(株高’且差异极显著!所以确定为高效异养硝化菌株*图#!异养硝化菌株氨态氮利用率及方差分析B35=$!4GG*-3+G-37,*5:-+73/3R.73*-,.7:*02:7:,*7,*U236-37,*;*Q.67:,3..-S,:;+/7*0.-./;3;*09.,3.73*-!!表$为%株高效异养硝化菌株在筛选培养基中氨态氮’亚硝态氮’硝态氮及总氮的质量浓度测定*结合图$和表$发现$菌株)a(&’!氨态氮利用率’即氨态氮的降低浓度是%株菌中最高的!同时培养基中生成亚硝态氮和硝态氮的浓度均为零*菌株Ka%&’$和)a%&’%的氨态氮利用率’即氨态氮的降低浓度均低于菌株)a(&’!!此!菌株虽能生成一定浓度的亚硝态氮和硝态氮!但其浓度明显低于氨态氮的降低浓度*再有!经总氮浓度测定!发现%株菌在试验结束时!各菌的总氮都呈现一定程度的降低!即存在一定量的氮素损失*!!自然界氮素循环中的氨态氮只有!种生物转化途径$一是用于同化作用!二是用于硝化作用*而硝化作用生成的硝态氮还可再经反硝化作用变成F!’F!]’F]及F]!等