基因操作的主要技术原理

第二章基因操作的主要技术原理基因操作技术主要包括（1）DNA分子的切割、连接、转化（2）核酸分子杂交，凝胶电泳以及序列分析，基因的人工合成，PCR扩增等第一节核酸的凝胶电泳第二节核酸分子杂交第三节细菌的转化第四节DNA序列分析第五节基因扩增第六节基因的定点诱变第七节蛋白质与DNA相互作用的研究方法第一节核酸的凝胶电泳一、核酸的凝胶电泳(Agarose&Polyacrylamide)1、简介将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。2、琼脂糖凝胶电泳•琼脂糖凝胶：琼脂糖是从海藻中提取处理出来的一种线性聚合物。（1）琼脂糖——海藻中提取的线性高聚物，电泳中EB染色，紫外灯下1ngDNA可以被检测到分离作用依赖于DNA的分子量及构型凝胶的种类及浓度对被分离的DNA的分子大小有影响琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中DNALadder的形成PCR产物的琼脂糖电泳（2）分辨能力同凝胶的浓度相关，能分辨50-200kb的DNA片段，浓度越低，孔隙越大，分离的DNA越大（3）影响DNA迁移率的因素①DNA分子量大小线状DNA分子的迁移速率与其碱基数目以10为底的对数值成反比。分子量越大，摩擦力越大，越难于在凝胶空隙中蠕行，迁移得越慢。②琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA片段，其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同。③DNA的构象分子量相同的超螺旋环状，带切口的环状及线性DNA通过凝胶时速度不一。熔点在65oC的琼脂糖凝胶，熔解后可在37oC保持液体形态，可直接用来回收DNA分子。（4）低熔点琼脂糖（LMP）LMP中的DNA分子加入苯酚抽提65oC加热熔解LMP形成沉淀，DNA在上清离心分离3、聚丙烯酰胺凝胶电泳①用于分离和纯化双链DNA的非变性电泳②用于分离和纯化单链DNA的变性电泳，凝胶中加入抑制碱基配对的试剂（尿素、甲醛）（1）原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。（2）聚丙烯酰胺凝胶分离范围如下：（3）制备：凝胶铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片所隔开，并封一绝缘胶布。（4）检测方法EB染色放射自显影硝酸银染色聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析4、脉冲电场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE）用于分离超大分子量的DNA，可分辨达到107bp的DNA分子原理：电场方向，电流大小和作用时间都在交替变换，使DNA分子能够随时调整其泳动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化45o夹角PFGEcanresolvelargeDNAfragments5、EB染色在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidiumbromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，能看到约1-10ngDNA所形成的条带。溴化乙锭（EtBr）一种具扁平分子的核酸染料，可插入到DNA或RNA分子的碱基之间。在300nm紫外灯照射下发射出荧光。6、其他染色方法SYBRGreenI核酸染料高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无需脱色或冲洗。至少可检出20pgDNA，高于EB染色法25-100倍。SYBRGreenI与dsDNA结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBRGreenI染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多种电泳分析。SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。银染色银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.DNA条带大小及量的估算5000（bp）300020001000750500250100基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水（0.1％焦碳酸二乙酯）来配制所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。6、RNA电泳第二节核酸分子杂交核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。一、DNA/DNA印迹杂交——SouthernBlot1、原理将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。2、SouthernBlot操作步骤DNA琼脂糖电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或显色80℃烘干1～2hr紫外线交联法：利用DNA分子上一小部分的胸腺嘧啶残基同尼龙膜上的带正电荷的氨基之间形成交联键。•转移方法电泳凝胶预处理：为了使大小不等的DNA都得到转移，要对凝胶作预处理，用0.25MHCl在溶液中作短暂的脱嘌呤处理后进行碱变性，使DNA分子发生断裂利于转移，并且碱性条件下的单链状态易于杂交放射自显影照片SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。二、RNA/RNA印迹杂交－Northernblotting1、原理1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northernblotting。2、操作过程mRNA提取甲醛变性电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或化学发光三、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交（dotblotting）和狭线印迹杂交（slotblotting）是在Southern印迹杂交的基础上发展的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置（多孔过滤进样器），使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。DotblotSlotblot仪器SampleDNA点阵DNAchip芯片ResultofanalysisDNA(cDNA,synthesizedoligonucleotide)Fluorescencelabeledsamples（cDNA）检测重组体克隆的菌落杂交技术5、菌落杂交核酸杂交常用几种膜的性能比较四、Probe(探针)NotesProbeisaspecificDNAorRNAfragmentwhichcanbindwiththesampleDNAorRNAfordetection.eg：ATCCGATCG--------Sourceofprobesynthesized,cloninggenomicDNAorcDNA,aswellasRNA.Probemustbelabeled(标记)beforehybridization.radioactive——αorγ32Pnonradioactive——biotin,digoxigenin(地高辛),fluorescentdyeInasinglestrandedformforhybridization核酸分子杂交法的技术路线比较菌落原位杂交菌落或噬菌斑转印到膜上抽提DNA/RNA提取DNA提取RNA裂解细菌或噬菌斑变性核酸样品琼脂糖凝胶电泳变性DNA将核酸点加到膜上将凝胶上核酸条带转移到膜上，同时变性将核酸固定在膜上→预杂交（消除非特异吸附位点）→加入核素标记探针进行杂交→漂洗膜（洗去非特异结合探针）→放射自显影或显色反应示踪斑点杂交Southern印迹Northern印迹一、转化——以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞1928年,Avery首次开展了肺炎球菌的转化试验感受态细菌——是指细菌处于容易接受外源DNA的状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、嗜血杆菌。有的在对数生长期发生，如E.coli。产生机制不明。第三节细菌的转化转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法；电穿孔法。（一）原生质体转化法除去细胞壁后加外源DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。例如：酵母细胞的转化利用蜗牛酶、松解酶等消化酵母细胞形成原生质体，在聚乙二醇和氯化钙的作用下，使DNA被俘获。（二）化学转化法1970年Mandel和Higa首先用CaCl2经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli。通常转化效率可达105-107转化子/μgDNA。大肠杆菌在0℃的CaCl2溶液中形成原生质球使之呈感受态（CompetentCells）加入DNA，42℃做短暂休克（90s），黏附在细胞表面的DNA进入筛选转化子，质粒DNA中的抗生素是筛选标记1、原理用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形，外源DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物而被吸附，经短暂42℃热休克，易于进入胞内而不被降解。（三）电穿孔法原理：利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面形成暂时性的微孔,质粒DNA可乘隙而入,在脉冲过后,微孔复原。比CaCl2法操作更简单，转化效率高（一般可达109～1010个转化子／μgDNA）,不仅无需制备感受态细胞,而且适用于任何菌株。二、细菌转化频率影响因素：1、DNADNA浓度、纯度、构型2、转化的条件温度、pH、离子强度等3、限制修饰系统一般选用寄主控制的限制和修饰系统上有缺陷的突变体，hsdR-和hsdM-突变体。三、真核细胞的转染1、转染方法磷酸钙沉淀DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染；人造膜显微注射2、筛选标志tk-NeorG418瞬时转染目的基因不整合进宿主基因组稳定转染目的基因整合进宿主基因组磷酸钙沉淀法:Ca2+促进哺乳动物细胞吸收外源DNA细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，将待转移的DNA加入氯化钙和磷