基因工程期末复习

基因工程第一章：1.基因工程：在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体的基因或基因组提取出来，或者人工合成的基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。(工具酶也是必备元件)基本用途：大规模生产生物活性物质，设计、构建生物的新性状甚至新物种。2.基因工程研究的主要内容：目的基因的分离与制备，DNA片段和载体的连接，外源DNA片段引入受体细胞，选择目的基因，目的基因表达。3.基因工程的意义：大规模生产生物分子，设计构建新物种，搜寻、分离和鉴定生物体。发展前景：农林牧渔业中的应用，工业中的应用，在医学中的应用。第二章：（结合课本划线内容）1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链，主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵；（发现的现象：寄主细胞的限制和修饰作用。）hsdR：编码限制性核酸内切酶，hsdM：编码限制性甲基化酶，hsdS：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达。（限制核酸内切酶类型：I型，II型，III型；）2.属名种名株名Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株先后分离出3种限制酶：HindIHindIIHindIII，EcoRI在抗药性R质粒上发现的第一个酶。同尾酶：识别不同的序列，能产生相同的黏性末端的酶；同位酶：不同微生物来源的酶，能识别相同的序列，切割方式相同或不相同。3.II型限制性核酸内切酶的切割方式：在识别序列的对称轴上同时切割形成平末端如EcoRV;在识别序列的双侧末端进行切割，若于对称轴5‘端突出的末端如EcoRI;反之产生3’端突出的末端如PstI。限制性核酸内切酶反应的注意事项：限制性核酸内切酶为浓缩酶；浓缩的酶液要用核酸内切酶缓冲液稀释，（不能用水稀释，以免酶变性）；核酸内切酶在含有50%甘油的缓冲液中，于-20度稳定保存；反应中尽可能少加水，使反应体积减到最小；延长反应时间，使所需酶量减少。影响限制性核酸内切酶活性的因素：DNA样品的纯度；DNA样品的甲基化程度；核酸内切酶的缓冲液性质；4.DNA连接酶基本性质：修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键；修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键；连接多个平头双链DNA分子。（注意：DNA连接酶所连接的是DNA分子上相邻核苷酸之间的切口，即Nick链接，不能链接两条单链DNA或环化的单链DNA分子。）DNA连接酶的种类：T4噬菌体DNA连接酶（最常用）、大肠杆菌DNA连接酶（最常见）、T4噬菌体RNA连接酶。5.DNA聚合酶：⑴大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质：5‘→3‘的DNA聚合酶活性；5‘→3‘的核酸外切酶活性；3‘→5‘的核酸外切酶活性。用途：主要用于杂交探针的制备。切口平移法是目前实验室中最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。⑵Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶；Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端；DNA片段的同位素末端标记；cDNA第二链的合成；双脱氧末端终止法测定DNA序列。⑶T4-DNA酶的基本特性：5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性；在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切；在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端（注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多）；DNA片段的同位素末端标记。⑷反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链；双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链6.核酸酶:⑴单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII），大肠杆菌的核酸外切酶VII反应不需要Mg2+。双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII），大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3‘端外切。单、双链核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo），l核酸外切酶特异性地从5‘端外切。⑵单链核酸内切酶：S1核酸酶，来自稻谷曲霉菌。基本特性：降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍，降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍，是降解单链RNA的核酸内切酶，反应条件：Zn2+必需，最适pH范围为4.0-4.3，需要NaCl10-300mM。S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA。⑶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶，来自艾氏交替单胞菌。基本用途：诱发DNA突变。⑷核酸修饰酶：①末端脱氧核苷酰转移酶（TdT），来自小牛胸腺。基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs。②碱性磷酸单酯酶：来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP），来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）。基本用途：催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA的5’磷酸变为5’-OH末端，防止载体的自身环化。③T4-PNP（T4噬菌体多核苷酸激酶）的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷，用于探针的末端同位素标记。7.如何防止载体自身环化作用？答：使用碱性磷酸酶处理，去除其5’末端的磷酸基团，这样载体DNA分子的两个黏性末端发生退火互补，失去了链接能力，不能形成共价环化结构，这种分子是不稳定的，在连接部位容易解链形成开环的线性分子，通过碱性磷酸酶预处理线性载体，提高插入片段的用量，可以有效防止载体自身环化。第三章1.在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。基因工程对载体的要求：在宿主细胞内能独立复制，有选择性标记，有一段多克隆位点。，外源DNA插入其中不影响载体的复制，分子量小，拷贝数多，容易从宿主细胞中分离纯化。载体的种类：质粒、单链DNA噬菌体M13、噬菌体的衍生物2.质粒:是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。质粒的一般生物学特性:分子小（1-200kb）、编码基因少、环形状（双链环状DNA）。质粒的空间构型：①共价闭合环状DNA（ccDNA)即SC构型，②开环DNA（ocDNA）即OC构型，③线形DNA（lDNA）。同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。质粒的基本特征：质粒的自主复制性，质粒的不相容性，质粒的可转移性，携带特殊的遗传标记。（拷贝数：细胞内质粒/染色体数）反应质粒复制的强度。质粒独立复制的三个特性：在宿主细胞内，单向，由自主和宿主细胞双重遗传控制。质粒的类型：（1）接合型质粒：如：F质粒。除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。在天然条件下，能从一个细胞自行转移到另一个细胞，大部分属于严紧型质粒。（2）2.非接合型质粒：如R质粒（抗性质粒）、Col质粒。虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。在天然条件下不能自己转移到另一个细胞中。大部分属于松弛型质粒，符合基因工程的安全要求。注：基因工程中所用的非接合型质粒载体缺乏转移所必须的mob基因，所以不能发生自我转移。质粒的复制类型：1.严紧型质粒：拷贝数少，只有1—3份拷贝。2.松弛型质粒：拷贝数多，有10—60份拷贝。3理想质粒载体的必备条件：常见可用于基因工程的天然质粒有pSC101、CoLEl。第一个用于基因克隆的天然质粒是pSC101，是一个严紧型质粒，每个宿主细胞仅有1-2个拷贝，具有多个限制性核酸内切酶的单一酶切位点；另一个天然质粒载体是CoLEl，它唯一单酶切位点EcoRI位于大肠杆菌素EI的编码基因内。质粒载体必须具备的基本条件：（1）具有复制起点；（2）具有抗菌素抗性基因；（3）若干限制性内切酶的单一位点；（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。多克隆位点：指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶酶切位点的DNA片段。抗菌素抗性:氨苄青霉素抗性(杀死生长的细菌)，卡那霉素抗性（杀死细菌），四环素抗性(杀死生长的细菌)，链霉素抗性（杀死细菌），氯霉素抗性（杀死生长的细菌）。3.重要的大肠杆菌质粒载体：（1）pBR322：松弛型复制、氯霉素可扩增、拷贝数50-100/cell、用于基因克隆。（2）pUC18/19：拷贝数2000-3000/cell、装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ、用于基因克隆和测序。注：pUC7是最早构建的一种PUC质粒载体。pGEM-3Z：多拷贝、装有多克隆位点（MCS）、正选择颜色标记lacZ、用于外源基因的高效表达。克隆载体：指专用于基因或DNA片段无性繁殖的质体载体。（名词解释）4.容菌周期（裂解周期）：感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。容原性周期：感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化。5.单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：M13、f1、fd噬菌体。特点：单链DNA；复制型（RF）是双链环状DNA；RFDNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌。并产生噬菌斑；不存在包装限制；可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。（1）M13噬菌体基本特性：寄主；DNA长度：6407bp；DNA提纯：容易提取；没有包装限制。优点：（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2）Xgal显色反应，可供直接选择（3）无包装限制，克隆能力大（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链。缺点：插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降。人工染色体：酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、P1派生人工染色体、哺乳动物人工染色体（MAC）。第四章1.基因组DNA提取方法：碱抽提法（最常用）、煮沸法、去污剂裂解法。碱抽提法提取质粒DNA原理：闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快，染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。碱抽提法提取质粒DNA的步骤：溶菌；破膜，蛋白质和DNA变性；中和；离心除去沉淀；纯化DNA；沉淀DNA。所用的试剂作用：①溶菌酶：能水解菌体细胞壁的肽聚糖中的-1，4糖苷键②葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压③EDTA：Mg2+、Ca2+的螯合剂，抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解④NaOH-SDS：NaOH使DNA双链变性，SDS溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，使蛋白质变性沉淀⑤NaAc-HAc缓冲液：用来中和NaOH变性液，使DNA复性⑥乙醇:用于沉淀DNA⑦RNaseA:降解RNA渣滓⑧TE缓冲液:DNA保存液⑨酚-氯仿:蛋白变性剂,使蛋白质沉淀。2.影响质粒DNA产量的因素：受体菌株；质粒拷贝数；质粒大小。(1).细菌基因组DNA的制备:（1）细胞裂解（2）DNA纯化（3）沉淀DNA(2)哺乳动物细胞基因组DNA的抽提:（1）组织粉碎（2）细胞裂解（3）纯化DNA（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染。（3）.从植物组织中制备DNA：（1）组织粉碎（2）细胞裂解（3）纯化DNA（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染。----（了解看看）3.DNA的定量和纯度测定：核酸在波长260nm处有最大的吸收峰，蛋白质的最大吸收峰在280nm。（注:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢）4.琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）,空隙大小决定其分辨分子大小的能力,空隙小，分辨率高，空隙大，分辨率低。聚丙烯酰胺凝胶电泳：优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的