基因组学作业

RNA干扰a-突触核蛋白基因表达对甲基苯丙胺中毒大鼠神经毒性的影响$$$研究生五班一、立项依据：甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是一种新型毒品,属于苯丙胺类神经兴奋剂(Amphetamine-TypedStimulant,ATS),其盐酸盐为透明的结晶体,外观状如冰,俗称“冰毒”。因具有见效快、兴奋作用维持时间长、价格低廉、化学合成技术简单、多途径摄取等特点,METH的滥用及蔓延速度极快,成为当今我国危害最为严重和滥用的两大毒品之一。METH的滥用不仅给个人生理及心理带来极大痛苦,更给家庭和社会带来沉重负担。因此,对METH神经毒性损伤的机制及其防治手段的研究己成为世界面临的重大课题和研究热点。METH为拟交感胺类兴奋剂,具有中枢神经兴奋性、致幻、食欲抑制和拟交感神经能效应等药理、毒理学特性。大量临床资料表明,METH可引起体内重要实质器官的损害,包括心、脑、肺、肝、肾等,但更主要的是对中枢神经系统的毒性。METH滥用能引起明显的行为和精神改变,导致大脑黑质、纹状体、海马皮质多部位损伤,可致动物大脑多巴胺能及五羟色胺能末梢损伤,包括纹状体内多巴胺(DA)含量下降,多巴胺转运体(DAT)降低,酪氨酸羟化酶(TH)活性减少,5-HT及代谢产物的耗竭,单胺囊泡转运体2(VMAT-2)及多巴胺摄取位点缺失,导致神经元、轴索损伤,神经细胞凋亡。目前,关于METH的神经毒性机制尚未完全明确。现阶段的研究结果显示多种机制和途径参与了METH的神经毒性。这些机制主要包括:①过量多巴胺的氧化作用及氧化应激损伤;②谷氨酸的兴奋性作用所致的Ca2+超载和细胞稳态破坏;③线粒体损伤和功能障碍;④激活多条凋亡相关通路、诱发神经元凋亡等。其中氧化应激是METH所致神经毒性损伤的重要作用机制。a-突触核蛋白由140个氨基酸构成的酸性可溶性蛋白,主要分布于神经元的核膜及突触前末梢。a-syn参与正常突触功能的维持,在调节突触可塑性和递质释放等方面有重要的作用;可以与许多信号蛋白、骨架蛋白、酶和离子等结合,有伴侣分子样活性的作用。a-syn基因敲除小鼠却未发现有明显功能损害和形态改变,表明其生理功能具有代偿机制。a-syn高浓度或过表达时又对神经元有细胞毒的效应。在高浓度时,a-syn形成细胞毒性更大的P-折叠寡聚物,这预示着该蛋白质的异常聚集和纤维化与帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)等神经退行性疾病密切相关。METH可导致大脑出现与上述神经退行性病变相类似的改变,并且METH使用者患PD的比率明显升高。最近的研究显示METH可以导致小鼠黑质纹状体区产生类似Lewys小体的包涵体。在PD等许多神经退行性疾病中,多巴胺递质释放减少、氧化应激、Ca2+超载、线粒体功能损伤和细胞凋亡等几种损伤机制密切相关、协同作用,而a-syn在其中扮演着重要的角色。当其浓度升高时既参与了神经损伤的启动,同时也变成损伤过程的效应蛋白,促进神经元变性直至死亡。a-syn的硝基化促进了其寡聚体的稳定性导致其毒性持续增强,因此,它有可能是METH神经毒性损伤中的靶蛋白。正如前面所述，METH所致神经损伤也包含上述几种损伤机制，而a-syn在皮质、海马和纹状体表达升高,这预示着ct-syn与上述损伤机制之间也存在着必然的联系，作为重要的靶蛋白参与了神经损伤的过程。本课题组前一阶段通过RNAi技术沉默人多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞中a-syn基因,发现干扰a-syn表达可抑制METH引起的细胞活力下降、TH、DAT、VMAT-2等基因水平下降、多巴胺耗竭和ROS、NOS、NO水平升高，能抵抗METH引起的线粒体ATm下降、MPTP开放、细胞外钙离子内流，抑制线粒体的细胞色素C释放进入胞浆，从而在一定程度上保护线粒体的正常功能、抵抗METH引起的细胞死亡。但这一结果尚未在体内得到验证，且a-syn究竟是通过何种路径参与METH的神经毒性损伤、其调控的靶蛋白究竟有哪些及其可能的机制尚未见报道，也正是本研究的意义所在。参考文献[1]郭东文,郑继旺.认识冰毒远离冰毒.中国药物滥用防治杂志,1998,4:14-17[2]刘志民.“新型毒品”及其危害.药物不良反应杂志,2005,7(4):272-273[3]蔡志基.全球毒品问题的现状与动向.中国药物依赖性杂志,1999,8(1):7[4]刘志民.苯丙胺类中枢兴奋剂滥用防治.中国药物滥用防治杂志,2002,38:4-14[5]刘铁桥,郝伟.苯丙胺类兴奋剂概介.国外医学精神病分册,2001,28(30):129-134[6]寇清,何卫平.急性甲基苯丙胺中毒34例临床分析.中国急救医学,2003,23(5):338-339二、研究内容：1.建立RNA干扰a-syn大鼠模型成年雄性Wistar大鼠,随机分成4组,①对照组(control,CON);②模型组(model,model);③阴性病毒组(emptyvector);④阳性病毒组(RNAi):使用本课题组前期合成并鉴定有效的a-syn-ShRNA重组病毒。利用脑立体定向注射技术向大鼠纹状体注射相应的物质,CON组和model组均注射生理盐水,emptyvector组注射阴性病毒,RNAi组注射a-syn-S_A重组病毒。注射后二周,取各组大鼠纹状体检测a-syn的表达,实时荧光定量PCR、WesternBlot分别检测a-syn在基因和蛋白水平的表达变化。2.研究RNA干扰a-syn对METH毒性损伤的影响利用成功建立的a-syn沉默大鼠模型,给予METH刺激,CON组腹腔注射生理盐水,model组、emptyvector组和RNAi组动物腹腔注射METH,剂量15mg/kg,每天早8:00点、晚6:00点各注射一次,连续注射4天,共8次。观察动物的行为变化,体重、进食量、饮水量的变化;酶联免疫吸附试验方法(ELISA)检测各组大鼠纹状体多巴胺(DA)和络氨酸羟化酶(TH)的含量;TUNEL法检测细胞凋亡;酶化学方法检测ROS、NOS、NO的活性变化,分别用ROS荧光检测试剂盒、NOS活性检测试剂盒、NOS检测试剂盒检测。3.RNA干扰a-syn与METH神经毒性相关差异蛋白质的筛选和鉴定每组取6个纹状体组织,取适量纹状体组织,加入SDT裂解液,匀浆均匀后超声裂解;离心取上清,利用BCA法进行蛋白质浓度测定。各取20ug蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色检测蛋白质量。各组取400ug样品进行酶解和肽段定量。分别取约64ug酶解后的肽段,用iTRAQReagent-4plexMultiplexKit进行肽段标记后,釆用纳升流速HPLC液相系统EasynLC进行分离,用Q-Exactive质谱仪进行肽段的定性和定量分析。三、研究目标：建立a-syn沉默大鼠模型,运用行为学、酶化学等方法,全面了解a-syn抑制后对METH导致的多巴胺系统和氧化应激系统损伤的影响;在此基础上,利用iTRAQ技术,筛选和鉴定出给予METH剌激及RNA干扰a-syn后,大鼠纹状体的差异表达蛋白质,结合已知蛋白质的功能,探讨a-syn在METH神经毒性机制中的作用。四、研究方案与技术路线：我们前期参照SapruMK等的实验方法，通过RNAi技术，在体外证实ct-syn参与了METH的神经损伤过程。但a-syn究竟是通过何种路径参与METH的神经毒性损伤、其调控的紀蛋白究竟有哪些及其可能的机制，这些都是本次研究要寻求的答案。目前,利用RNA干扰技术定向敲除某个基因成为国内外的研究热点，而且RNA干扰技术已经成熟稳定，敲除效果得到了国内外同行的一致认可。相对于传统的基因抑制相比，RNAi技术具有更强大、更持久地抑制基因表达的能力，其效能是反义寡核苷酸的100~10000倍，并且具有高度的序列特异性，无免疫原性，能克服蛋白抑制剂应用中所存在的不足。iTRAQ(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation)技术是由美国应用生物系统公司ABI研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。iTRAQ技术灵敏度高，样品需求量少，相对于传统技术能够筛选出更多的差异蛋白。本课题拟采用RNA千扰技术合成并鉴定有效的a-syn-S_A重组病毒，通过脑立体定向显微注射重组病毒至大鼠纹状体，从而获得a-syn抑制大鼠模型；再给予METH刺激后,观察大鼠行为学、多巴胺系统和氧化应激系统等的变化，探讨变化发生的可能机制，阐明a-syn在METH神经毒性损伤中的关键靶蛋白作用；采用iTRAQ技术对ct-syn抑制大鼠模型给予METH作用后差异蛋白质的筛选和鉴定，筛查和a-syn密切相关的靶蛋白，以明确这些蛋白和METH神经毒性之间的联系，为METH神经毒性损伤的预防和治疗提供一定的理论基础和新的研究方向。五、预期成果：1.成功建立RNA干扰a-syn大鼠模型,在基因和蛋白水平都证实了a-syn表达量的下降；2.筛选和鉴定数个RNA干扰a-syn与METH神经毒性相关差异蛋白质；3.发表相关论文2-3篇。六、研究计划及进度：2015.1-2015.5建立RNA干扰a-syn大鼠模型。2015.6-2016.12研究RNA干扰a-syn对METH毒性损伤的影响。2016.1-2016.6RNA干扰a-syn与METH神经毒性相关差异蛋白质的筛选和鉴定。七、实验条件与基础：1、工作基础：申请人从事肿瘤发生的分子机制，神经疾病的免疫及基因治疗研究多年，发表研究论文19篇，其中6篇被SCI收录，影响因子多达40。在美国华盛顿大学神经肿瘤及分子遗传研究室从事神经系统肿瘤发生的分子机制的研究工作近4年，主要从事脑胶质细胞瘤发生、发展的分子机制，利用基因芯片寻找与脑胶质细胞瘤发生发展相关的遗传改变，并利用已知的脑胶质细胞瘤的遗传改变，如Ras激活突变，NF1基因缺失，cdk4过表达，P53及Rb缺失，并在动物模型上进一步验证上述遗传改变与脑胶质细胞瘤发生发展的关系。首次利用GFAP启动子成功地建立了脑胶质细胞特异性CDK4基因过表达的动物模型，并揭示了CDK4过表达与P53基因缺失对脑胶质细胞增殖的协同作用。该文发表于Oncogene2002,21:1325-1334（影响因子6.0）。该CDK4转基因鼠系正在申请美国专利。同时，探索研究新基因如T-cadherin和GAP43基因对脑胶质细胞瘤生长、转移等恶性生物学特征的关系，首次发现T-cadherin和GAP43是两个重要的参与脑胶质细胞瘤生长调控的基因，并揭示其调节机制。论文分别发表于MolecularandCellularBiology2003,23:566-578（影响因子8.8）和CancerResearch2003,63:2933-2939（影响因子8.3）。参加在美国和印度召开的国际会议3次，在研究基因功能与肿瘤恶性生物学特征的关系、肿瘤发生的分子机制及治疗研究领域积累了丰富的经验。在对T-cadherin基因的研究中，首次证明了细胞粘附分子T-cadherin是抑制脑胶质细胞瘤生长及转移等恶性生物学特征的重要肿瘤抑制基因，并揭示其分子机制是T-cadherin分子通过诱导P21CIP1/WAF1表达致使肿瘤细胞于细胞周期G2期阻滞。该文发表于MolecularandCellularBiology2003,23:566-578。这一研究发现为进一步研究T-cadherin分子在肝癌中的作用、功能及临床意义奠定了坚实的基础。2、工作条件我院普通外科是国家重点学科，长期以来又以神经科为重点，已培养出硕士、博士研究生60余名。神经疾病发病的分子机制及综合治疗一直是我科的重点研究项目，已发表研究论文三百余篇。近年来基本外科实验室已投资近200万元增购仪器设备，配备充足的研究人员,已具备从事相关分子生物学研究、细胞学研究及动物试验研究的实验条件。本院神经内科中心拥有床位78张，具有收集