基因细胞内导入技术

《医用细胞工程》杨吉成等主编，2001年上海交通大学出版社出版第21章基因细胞内导入技术.doc一、基本概念(一)基因导入(或基因转导)将外源性基因(或基因组DNA)采用分子生物学技术人工地导入细胞，观察它在细胞中的表达，研究其生物学特性和功能，这种把基因导入细胞中的技术称为基因转导(genttransfer)或称基因转移，也简称为导入。是研究基因表达、结构和功能的重要研究手段。(二)基因转导的种类：目前基因转导技术很多，可根据研究目的、对象和实验条件加以选择。1、染色体转导：将染色体(甚至是全套染色体)和分离提取的细胞核或DNA大分子片断，可采用细胞融合或细胞显微注射法将染色体或染色体片断导入细胞内并与受体细胞(或称宿主细胞)发生DNA整合，研究整合的细胞特性和功能，这种转导称为染色体转导，这项技术在细胞融合和单克隆抗体杂交瘤技术中已介绍，本章从略。2、基因转导：将已克隆到的目的基因（或基因的DNA片断或序列），转导入离体细胞中进行表达的方法称基因转导，它有两类：一类是将目的基因转导入体外培养的细胞，另一类是导入从体内取出的细胞中，观察目的基因在细胞中表达，这项技术称基因转染(genetransfection)。体外培养的人体细胞可以是已建立的细胞系(株)包括二倍体正常细胞。如同体内细胞，如淋巴细胞、LAK细胞、TIL细胞等，基因导入后再回输体内，已用于基因治疗(genetreatment),另一类是将已克隆化的目的基因导入受精卵，导入基因后的受精卵植入子宫，发育成胚胎和个体，可在胚胎期和出生后观察目的基因在整体内的表达，此项技术称转基因技术（transgenictechnique）,转基因技术所产生的动物称转基因动物(transgenicanimal)。基因转染的方法常用磷酸钙法、脂质体介导法、电击法(电穿孔技术)、DEAE葡聚糖法、细胞显微注射法等，这均属于物理、化学方法的转基因技术，此法转入至细胞内的基因一般均不与细胞染色体发生整合，而是在细胞质呈现暂时性表达，但不持久，随时间推移而逐渐减弱或消失，为了使目的基因进入细胞后能与细胞基因组DNA发生整合、产生永久性的表达，常用病毒载体将目的基因导入细胞，并发生整合，如用逆转录病毒、疱疹、腺病毒等改建的病毒载体、因此基因细胞内转导技术可归纳如下：细胞融合技术染色体转导染色体转导(显微注射法)基因细胞内转导基因转染磷酸钙沉淀法、电击法、脂质体法、(体细胞)显微注射法、逆转录病毒等病毒介导法基因转导其它转基因技术(生殖细胞)(三)目的基因和受体细胞选择1、目的基因的选择：从基因来说，存在有功能性基因和诱发细胞转化的基因及使癌细胞发生逆转分化的抑癌基因，功能性基因表达时能产生特定的功能性蛋白，如细胞因子IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2～IL-18、TNFα、CSFS、EPO、TPO等有功能性基因可选用来进行基因制药。另一类是诱发转化的基因，可诱生细胞发生无限制增殖，发生永生化和恶性化的细胞转化，因此细胞转化试验应选用癌基因或原癌基因。还有一类基因可以诱导细胞分化，使肿瘤细胞逆转向正常细胞分化。因此在研究对肿瘤细胞诱导分化时，应选用抑癌基因。细胞培养已成为研究基因、癌基因和抑癌基因表达的重要手段。2、受体细胞的选择：不同的受体细胞对导入后基因表达有很大影响，同样的目的基因进入不同的受体细胞中表达能力差异较大，有的为高表达，有的呈现低水平表达，有的甚至不能表达，如β-球蛋白基因在导入MEL14(ATCC、HB132)细胞中能促进细胞发生分化，具有高表达功能，但导入HELA细胞中却无表达，因此受体细胞的选择也应引起关注。基因导入细胞后的表达与受体细胞性状、细胞种类和细胞来源密切相关。此外，若目的在于获取瞬时表达效果可采用磷酸钙沉淀法、电击法、脂质体法等；若目的要获取永久性稳定表达应选用逆转录病毒等病毒载体导入法。下面介绍几种常用基因转染方法。二、物理化学法基因转染技术(一)磷酸钙-DNA共沉淀法核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。1、配液(1)2×HBS1.63gNaCl1.19gHepes0.023gNa2PO4、2H2O加水至100mlpH7.1过滤，4℃保存(2)2mmol/LCaCl2过滤除菌(3)TE：0.1mmol/LEDTA1mmol/LTris-HCLPH8.0(4)G418(新霉素G418)液：1gG418溶于1mmol/LHepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。2、操作步骤[方法一]：(1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/LCaCl2混匀30秒。③然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。(4)转染受体细胞①将处于对数生长期已占瓶底50～70%的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml（25ml培养瓶）。②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀，加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。③置37℃5%CO2培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。⑤更换浓度800mg/L的G418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。⑥培养大约3～5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基，每3～4天更换一次选择培养基。⑦2周后对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现，待其增大后再进行克隆化和扩大培养，可建立转化细胞株，并做进一步鉴定。本实验要加入PSV2-neo、DNA与外源DNA共转染受体细胞，这样可使受体细胞获得新霉素(neo)基因的抗药性，这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”，也可测出转入的外源性基因的抗neo的标记。而且还可利用被neo基因导入的受体细胞通过G418选择培养筛选转化的细胞建立细胞株。若以获取“转化灶”为目的，可不加入PSV2-neoDNA只需将从癌细胞中提取的基因组DNA导入受体细胞即可，其方法如下：3、基因组DNA转染[方法二]：(1)配制磷酸转染液NaCl8.0gHepes5.0g用时现配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65Na2HPO40.099g消毒灭菌-20℃贮存备用加温水至1000mL(2)按前面介绍的方法提取癌细胞基因组DNA。(3)取供体基因组DNA50～100μg,加3MNaCl或醋酸钠，使最终浓度至0.3M混匀。(4)再加2倍体积无水乙醇3000r/min离心10分钟，去上清。(5)加入转染缓冲液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含最终浓度为125mM，用吸管轻轻吹打三次(不用搅拌器以防DNA袢结)，置室温下10～30分钟，待液体透明度降低，出现微浊兰色时，即可用于转染细胞。(6)取生长状态良好处于半汇合阶段的对数生长期细胞，在转染前4小时，更换培养液(5ml/瓶)1次。(7)转染：向每瓶中加DNA-磷酸钙沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小时。(8)培养：弃去培养液，用15%甘油处理3分钟，无血清培养漂洗1次，接近汇合时血清用量降至5%，培养2～3周。(9)检测：逐日观察，待出现“转化灶”后，克隆分离，扩大培养建立转化细胞株。(二)脂质体介导DNA转染法脂质体(lipofectinregeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n,n-TrimethylammoniumChloride(DOTMA)和Dioleoylphotidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1～5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2～24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。1、操作步骤[方法一]：(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1～2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%～60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。(2)转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μgDNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL,轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6～24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50～60%板底面积。(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。③室温下放置5～10分钟，使DNA结合在脂质体上。(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mLDNA/脂质体复合物，37℃培养3～5小时。(4)再于每孔中加入20黃的DMEM，继续培养14～24小时，(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10黃的DMEM，2mL/孔，再培养24～48小时。(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。稳定的脂质体转染方法如下：(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。(3)在每孔中加入1mL、20黃的DMEM，37℃培养48小时