基因芯片细胞标本采集操作建议规程

一个完整的基因芯片实验包括以下几个步骤：研究课题的提出、芯片设计、样品制备、杂交反应、数据分析和处理。本文主要介绍其中的样品制备(细胞标本采集和组织标本采集)的建议做法。细胞标本采集操作建议规程1.所有样品均应有样品标签(注明样品编号)，同时有一张样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等。2.一张芯片实验一般要求细胞数在1E+08，建议设计实验和收获细胞时可考虑多收集一些。3.贴壁与悬浮细胞培养诱导结束后，去除培养液，保留的细胞用PBS缓冲液洗一下，除去缓冲液，加溶液D*充分溶解细胞，放入液氮运输。样品量以实际得到的totalRNA为准。4.血液：将白细胞分离出来，加溶液D充分溶解细胞，放入液氮运输。样品量以实际得到的totalRNA为准。5.如果是细胞未经溶液D处理，直接冻入液氮罐(不推荐)。工作人员会对细胞作相关处理，以便为细胞记数。6.以上提到的均是新鲜细胞，对一些已老化或质量不明的细胞，工作人员有权提出疑义，并要求退回或重新取样。不同组织抽提3-10μgmRNA所需组织量考虑到个体差异以及样品在研磨、匀浆等过程中的损失，客户提供的样品量应在上述基础上增加1-2倍。组织标本采集操作建议规程铝箔经DEPC水浸泡过夜，78°C烘干，高压灭菌后烘干1.5ml微离心管15ml聚丙烯离心管市场有售RNAase-Free的相应规格离心管标签纸记号笔样品登记表由客户指定专人填写液氮罐应常备液氮罐，并保证液氮的来源取材部位的病理切片由客户提供1-2张注：·以下步骤1-5应在冰上进行且不超过15分钟，超过时间会导致样品的RNA降解。·对肿瘤组织的取材，要求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，例如对于手术切除的整个或部分前列腺，可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。1.离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，剔除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜;肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净(正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净)。2.在RNase-Free0.9%生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。3.用铝箔包裹组织，或用5ml冻存管装载组织(但最好统一采用铝箔)。用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入液氮冷却。4.填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等。5.将液氮冷却的组织放入样品袋(每个样品袋只保存同样的组织)，袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸(标签上注明：样品名称、编号、日期)，迅速转入便携式液氮罐。6.保留1-2张取材部位的病理切片。基因芯片样品的制备要点：1.目的DNA的选择对于大规模地研究基因表达问题，需要分析每一个基因的表达。因此，选择的目的DNA必须能够代表要研究的各个基因。对于整个基因组序列全部已知的生物，最直接的方法是用PCR扩增基因组中每个已知的或预测的开放阅读框架(openreadingframe)，亦可以选择自己感兴趣的部分序列。对于没有测序，或只有部分测序的基因组，或者对于那些有大量内含子的基因组，上述方法就不现实。在这种情况下，我们首先考虑采用表达序列标记(EsT)。可以将单个EST的cDNA克隆用作阵列DNA来源。对于还没有基因组测序计划或序列还未知的生物，可以利用cDNA文库作为DNA来源。当然这种文库最好是经归整化处理过，以减少不必要的冗余。用作阵列的DNA可以是双链的，亦可以是单链的。但是其长度最好是小于开放阅读框架，或小于1000bp的cDNA。这对于很多具有同源性的基因尤为重要。当基因之间具有很高同源性时，最好选择基因之间有差异的部分，这样便可以提高基因之间的分辨度。所以，在考虑每个基因代表性的同时，应充分考虑所研究问题的具体情况。2.pcR扩增一般而言，100uLIPCR反应体系得到的产物足以点印：000个基因芯片。PcR通常是在96孔PCR仪上进行扩增。实际扩增的反应条件要根据所用的模板及引物来确定。但要尽量减少PCR反应体系中的组分，尽量只用模板、引物、核昔酸、Mg标准缓冲液和酶。不要用甘油或明胶，它们往往会粘附在阵列块上而影响以后的点样工作。3.点样前DNA准备点样以前，要将pcR产物清洗纯化干净，并且对DNA进行一些处理，一般用异丙醇沉淀PCR产物，以除去酶、离子及核昔酸等。沉淀后用70%乙醇院1次，再用95%乙醇洗1次，待完全干燥后，将所沉淀DNA重溶在3xSSC中，其浓度掌握在100ny…左右、由于处理的样本量很大，一般直接在96孔板上直接操作，可选用能够配置96孔板的离心机(如SavantSpeedVacPlussC210A)。当把DNA溶于10～15tL13XSSC(pH7.0)中后，最好置于4”C至少12h。然后，将DNA溶液封存在一20C～4”C。除极个别特殊的样品外，大多数的生物样品不能与基因芯片反应。对此，应该对样品进行提取扩增获取其中的目的蛋白质或基因，然后标记，可提高检测的灵敏度和实验操作人员的安全性。