哺乳动物细胞质量控制

哺乳动物细胞质量控制1.宿主细胞的选择1.1宿主细胞的来源、历史和一般特性1.1.1宿主细胞的来源和历史应提供宿主细胞来源的相关资料和证明性文件，说明是否曾进行过遗传操作引入外源基因序列，描述已进行过的研究检定项目（细胞鉴定、内源和外源性银子检测））及引进时进行的复核检定结果。1.1.2宿主细胞的一般特性需阐述宿主细胞的基本特征，如形态、培养和生长的一般特性，培养条件和培养液要求。新构建的细胞系应检测致瘤性特征。2重组工程细胞克隆构建过程、筛选和鉴定过程2.1目的基因的来源应包括最初或的目的的基因序列的来源和背景方面的资料，用于制备目的基因cDNA的方法、以及必要的初步序列分析。2.2表达载体的具体构建步骤需说明表达载体组成成分以及主要元件的来源和功能，包括插入基因和侧翼区序列、复制子、启动子、增强子、抗性标记以及主要的酶切位点等。应该详述表达载体的构建或改建过程。对构建成功的表达载体应进行必要的鉴定，并提供相关试验资料，如构建中所用位点的酶切图谱。2.3载体引入宿主细胞的方法及重组工程细胞的筛选应详细说明载体引入宿主细胞的方法和操作过程，重组细胞的筛选原理、条件和标准，以及采用何种方法增加基因拷贝数等。阐述外源基因引入宿主细胞后产生的变化，符合筛选标准的候选细胞可能为多个细胞株，但拟用于建库的细胞株应为经研究比较后确定的单一细胞克隆。2.4重组工程细胞的初步鉴定应检测重组后细胞基本形状的改变，比较研究插入外源基因后细胞致瘤性特征的改变。应说明表达载体在宿主细胞内的状态（是否整合到染色体）并采用适宜的方法测定其拷贝数。说明启动和控制目的基因在宿主细胞中表达所采用的方法，并初步的表达产物鉴别和表达水平检测。对于选定的工程细胞株应进行充分的目的基因全序列确认，以保证用于编码和表达的产物的基因在初始核苷酸序列上的正确性。3.重组工程细胞库的建立3.1细胞库的建立细胞库可以分为三级：原始细胞库、主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）；也可以采用主细胞库和工作细胞库组成的两级细胞库；在某些特殊的情况下，也可以采用主细胞库一级库。用于建库的初始工程细胞株应为经过克隆选择而形成的均一细胞群体，必要时须经与实际生产过程中采用的无血清培养基和培养条件相一致的适应性培养。3.2建库细胞的管理在制备WCB过程中不得进行单克隆筛选，以避免由于个别基因突变引起WCB中细胞群体性的遗传特性改变；为了保证细胞库中每个容器中的内容物完全一致，如培养细胞采用几个器皿的，应将所有器皿中的细胞混合成单批后再分装。在细胞库的建库期间，应采取适宜的预防措施，以确保细胞不被污染（包括微生物污染和实验室中其它类型细胞的交叉污染等）上述各级种子库的细胞应该按照特定的要求经过全面检定合格后方可使用（具体要求见细胞库检定）细胞建库过程参见中国药典三部（2005）4.细胞库的检定正确的起始细胞是实现良好生产的前提和基础。检定的目的是为了确认经过初步筛选建库的细胞符合预期设计要求，携带有稳定的目的基因，能够持续表达有功能活性的目的产物，没有微生物污染和混杂其他细胞，能够直接扩增储备或用于生产。对于原始库细胞或主库细胞，通常需要进行一次全面系统的研究检定，包括遗传学、生物学和微生物学，以便从源头开始严格控制起始细胞的一致性和防止污染。经过传代稳定性研究的主细胞到工作细胞，只经过简单的传代、扩增，可以适当简化检定项目，重点检测外源因子污染和防止混入了其他细胞。保存的数目和传代水平应保证生产用细胞的持续稳定供应。5.细胞鉴定5.1细胞种属的鉴定应验明细胞的种属来源，分析细胞的同一性，排除与其他细胞的交叉污染。目前常用的方法有细胞生长特征和培养形态学检查，种属特异性抗原检测，染色体核型分析，同工酶分析，限制性内切酶分析，基因多态性分析等。应结合具体细胞固有的特性进行适宜的组合和选择，以实现正确的鉴别为目的。5.2致瘤性试验应检测分析目的的基因引入细胞后的致瘤性特征，对于阳性细胞，应研究确定致瘤性改变对产品带来的安全性风险。5.3目的基因和表达框架分析目的基因和表达框架的确证是种子库细胞检定的重要组成部分，对于标的正确的目的产物具有先觉性意义。常用的方法包括：通过PCR扩增样本DNA或用从细胞基质中分离的RNA制备的cDNA来进行DNA序列分析；通过限制性内切酶谱和Southern杂交来检测基因的完整性，确定目的基因的拷贝数，并检测是都有任何序列插入或缺失等。基因序列分析资料应包括试验方案和步骤、原始测序图、测得序列以及翻译后的氨基酸序列，同时应将实际测得序列与理论序列进行对比，清楚标注两者之间的差异。为保证产品结构的正确和稳定，基因序列分析应贯穿与重组工程细胞的筛选和鉴定、细胞库的建立和检定及生产细胞培养监控的全过程。5.4表达产物检测应检测分析目的产物的表达量和生物活性。活性检测应选择与其治疗机理相对应并能够定量的方法。活性测定方法学研究可贯穿于药品研究的始终，并经相关验证分析。5.5微生物污染检测5.5.1细菌、真菌和支原体检查应对MCB、WCB和EPC（生产终末期细胞）进行全面检查，对生产培养过程中的细胞进行监测。在进行支原体检查时，应注意同时进行培养法和指示细胞法两种方法。必要时可采用扫描电镜法检查细胞是否受到特殊微生物的污染。5.5.2病毒因子的检查包括细胞来源宿主动物潜在的内源性病毒和由于操作带入的外源性病毒的检查。对细胞进行病毒检查的种类和方法，应根据细胞的种属和组织来源、传代历史和细胞特性选择。5.5.2.1体外试验应将MCB、WCB和EPC细胞活细胞或细胞裂解产物接种到尽可能多的病毒易感的指示细胞上。可以根据细胞来源，传代史和细胞培养基的原料使用情况来选择适宜的指示细胞。检测结果应为阴性。5.5.2.2体内试验通过接种乳鼠、成年小鼠、鸡胚、豚鼠、家兔或其他敏感动物来检测细胞培养物中潜伏性病毒。通常要对MCB和EPC进行体内试验。5.5..2.3种属特异性病毒的检查通过抗体产生试验来检测可能存在于MCB细胞中的种属特异性病毒，如啮齿类动物来源的细胞应进行小鼠、大鼠或仓鼠的抗体生成试验。严格控制对人类有危害的鼠源性病毒。5.5.2.4逆转录病毒的检测逆转录病毒的试验应包括感染性试验、逆转录酶（RT）检测和电镜技术检查。应采用上述方法对MCB和EPC细胞进行逆转录病毒的检测。5.5.2.4.1感染性试验应根据细胞的特性及可能存在的逆转录病毒种类选择适宜的检测方法，如XC空斑试验、延时XC空斑试验、S+L-灶点分析等。试验时应注意设立恰当的阴性、阳性对照。5.5.2.4.2逆转录酶检测为提高检测的敏感性，通常需要将受试细胞经适当的化学诱导剂诱导后，收集上清液分别与检测细胞联合起来，再检测逆转录酶的活性，注意设立恰当的阴性、阳性对照。5.5.2.4.3透射电镜检查