复杂化合物的分离分析方法

1复杂化合物的分离分析方法一超高效液相色谱（一）UPLC仪器2（二）基本信息超高效液相色谱（UltraPerformanceLiquidChromatography\UPLC）是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC（高效液相色法）的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。超高效液相色谱是一个新兴的领域，作为世界第一个商品化UPLC产品的WatersACQUITYUPLCTM超高效液相色谱系统在1996年问世，之后像安捷伦、岛津等公司也陆续开始生产超高效色谱仪。目前，超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入液相实验中。（三）优缺点超高效液相色谱法的原理与高效液相色谱法基本相同，所改变的地方有以下几点：（1）小颗粒、高性能微粒固定相的出现。高效液相色谱的色谱柱，例如常见的十八烷基硅胶键合柱，它的粒径是5um，而超高效液相色谱的色谱柱，会达到3.5um，甚至1.7um。这样的孔径更加利于物质分离（2）超高压输液泵的使用。由于使用的色谱柱粒径减小，使用时所产生的压力也自然成倍增大。故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输液泵。（3）高速采样速度的灵敏检测器。（4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器。配备了针内进样探头和压力辅助进样技术；（5）仪器整体系统优化设计。色谱工作站配备了多种软件平台，实现超高效液相分析方法与高效液相分析方法的自动转换。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。不过由于实验过程中仪器内部压力过大，也会产生相对应的问题。例如泵的使用寿命会相对降低，仪器的连接部位老化速度加快，包括单向阀等部位零件容易出现问题等。（四）应用如今，超高效液相色谱仪主要应用于（1）药物分析如天然产物中复杂组分的分析（2）生化分析如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品（3）食品分析如食品中农药残留的检测（4）环境分析如水中微囊藻毒素的检测（5）其他如化妆品中违禁品的检测超高效液相色谱仪尤其对中药研究领域的发展是一个极大的促进。中药的组分复杂，分离困难等问题都可以通过超高效液相色谱法逐渐解决。在同样条件下，UPLC能分离的色谱峰比HPLC多出一倍还多。在同样条件下，UPLC的分辨率能够认出更多的色谱峰。超高效液相色谱的超高分析速度,超高灵敏度将为复杂体系中药的分离分析开创崭新的局面（1、6、8）。超高效液相色谱(UPLC)在分离能力、灵敏度和专属性等方面有着巨大优势,与质谱(MS)联用后可以展现出强大的定性、定量分析能力,并已经在药物研究的各领域得到广泛应用(7)。（五）图谱说明1、UPLC和HPLC方法对丹参药材中丹酚酸B含量测定结果的比对结果：两种方法所得含量测定结果一致。结论：超高效液相色谱方法能够替代高效液相色谱分析方法测定丹参药材中丹酚酸含量,既加快了分析速度,达到了样品分析的高通量,减少有机溶剂的使用,又得到更高的分析灵敏度。（2）图谱说明：2、HPLC、UPLC测定芪参益气滴丸中5个丹参活性成分含量的比较研究（3）结果:UPLC的分析时间少于HPLC;5个物质在一定范围内均呈现良好线性,r均大于0.9998;2种方法的精密度、重复性、加样回收率和样品测定结果无显著性差异。结论:HPLC和UPLC2种方法准确性、重复性均较好;UPLC分析比HPLC具有更加快速、高效的优势。图1对照品(A)、样品(B)与阴性样品(C)的HPLC与UPLC图谱Fig1HPLCandUPLCchromatogramsofreferencesubstances(A)，samples(B)andnegativesamples(C)1．丹参素(danshensu)2．原儿茶醛(protocatechualdehyde)3．迷迭香酸(rosmarinicacid)4．丹酚酸B(salvianolicacidB)5．丹酚酸A(salvianolicacidA)3、化橘红黄酮类成分UPLC与HPLC指纹图谱的比较研究（4）结果：分别建立了化橘红黄酮类成分的UPLC与HPLC指纹图谱共有模式。其中UPLC法标识出21个共有峰,HPLC法标识出17个共有峰,17批样品的相似度均大于0.9。结论：2种方法均可用于化橘红的质量控制,UPLC法较HPLC法更高效、快速、灵敏。011.4322.8634.2945.7257.1468.5780.00t/min图一17批化橘红药材的HPLC对照指纹图谱（标示出17个共有峰）01.142.293.434.575.726.868.00t/min图217批化橘红药材的UPLC对照指纹图谱（标示出21个共有峰）4、HPLC和UPLC法对比测定千里香药材中九里香酮的含量(5)结果：HPLC法中九里香酮与相邻色谱峰的分离度为2.76,85min内完成测定;UPLC法中九里香酮的分离度为1.93,在17min内完成测定,较HPLC法,分析速度提高了5倍。UPLC法中九里香酮的检测限为0.8ng,HPLC法为1.1ng,UPLC法更加灵敏可靠。图谱说明参考文献：[1]金高娃,章飞芳,薛兴亚,肖远胜,徐青,梁鑫森.超高效液相色谱在复杂体系中药分离分析中的应用.世界科学技术一中医药现代化★组分中药系统研究2006,8(3):106-111[2]陈佳，王刚，姚玲文，林瑞超.UPLC和HPLC方法对丹参药材中丹酚酸B含量测定结果的比对.药物分析杂志，2008，28（5）：749-751[3]王静，魏娜，赵洪芝，白钢，罗国安.HPLC、UPLC测定芪参益气滴丸中5个丹参活性成分含量的比较研究.药物分析杂志，2011，31(9):1678-1682[4]邓少东，王莲婧，林励，肖凤霞，帅欧.化橘红黄酮类成分UPLC与HPLC指纹图谱的比较研究.中草药，2013,44（9）：1195-1198[5]王静,韩正洲,杨立伟,徐强,杨海宏.HPLC和UPLC法对比测定千里香药材中九里香酮的含量.药物分析杂志，2010,30(8):1499-1502[6]杨义芳.超高效、高分离度快速、超快速液相色谱在中药及其制剂研究中的应用.中草药,2008,39(8):1259-1662[7]黄昆,王文辉,李宝才,王齐,杨俊,李晚谊.超高效液相色谱和质谱联用在药物研究领域的应用.光谱实验室.2009,26(4):922-927[8]陈佳,王钢力,姚令文,林瑞超.超高效液相色谱在药物分析领域中的应用.药物分析杂志,2008,28(18):1976-1980二、毛细管电泳芯片毛细管电泳芯片是在常规毛细管电泳的原理和技术的基础上，利用微加工技术在平方厘米级大小的芯片上加工出各种微细结构，如通道和其它的功能单元，通过不同的通道、反应器、检测单元等的设计和布局，实现样品的进样、反应、分离和检测，是一种多功能化的快速、高效和低耗的微型实验装置。