多糖结构的分析

多糖结构分析多糖在生物学上的重要意义，尤其是在医药学上的重要意义决定了多糖研究的迅速发展，多糖构效关系的研究已成为多糖研究的热点。但由于多糖结构的复杂性和多样性，其结构测定远远落后于蛋白质和核酸,本实验选择天然多糖（半乳葡萄甘露聚糖）作为实验材料，对其一级结构做初步的分析。多糖一级结构的分析包括：纯度鉴定，分子量测定，单糖组成测定和糖链的序列测定。糖链的序列测定包括：单糖残基在糖链中的次序，单糖残基间连键的位置，链的分支情况等诸多方面。【实验目的】1.了解多糖结构分析的内容及方法。2.了解多糖一级结构分析的基本原理。3.掌握多糖一级结构分析的基本方法。一、糖含量测定【实验原理】苯酚—硫酸试剂与游离的或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。【实验材料】1.实验器材721型分光光度计。2.实验试剂(1)98％的浓硫酸。(2)80％苯酚：80g苯酚加20ml水使之溶解，可置冰箱中避光长期贮存。(3)6％苯酚：临用前用80％苯酚配制。(4)标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解，定容至1L。(5)多糖样品：半乳葡萄甘露聚糖溶液（0.1mg/ml）。【实验操作】1.制作标准曲线：取9支干燥试管，按下表操作管号012345678标准溶液（ml）00.40.60.81.01.21.41.61.8蒸馏水（ml）2.01.61.41.21.00.80.60.40.26％苯酚（ml）1.01.01.01.01.01.01.01.01.0浓硫酸（ml）555555555静止10分钟，摇匀，室温放置20分钟A490横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。2.样品含量测定：取样品液1.0ml，按上述步骤操作，测光密度。3．计算:糖含量(%)=C/（C0×V）×100%C:由标准曲线查得的糖微克数C0：样品溶液的浓度（0.1mg/ml）V：测定时用的样品溶液体积（1.0ml）二、单糖组成分析【实验原理】多糖在浓硫酸中保温一定时间可完全水解为单糖，通过纸层析分离，特定试剂显色后与已知糖的标准混合物作对比，可以鉴定多糖水解产物中单糖的组成。【实验材料】1.实验器材水解管；滤纸；玻璃毛细管；层析缸；喷雾器。2.实验试剂⑴标准糖溶液:称取一定量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖，用蒸馏水溶解，得标准糖混合溶液(每种糖的点样量为20微克~30微克)。⑵展层剂：正丁醇：乙酸：水=4：l：5(上层)。⑶显色剂：苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液(邻苯二甲酸1.6g溶于水饱和的正丁醇100ml，加苯胺0.93g（相当于0.9ml）。⑷BaCO3；1mol/L硫酸。【实验操作】l．完全酸水解：称取20mg多糖样品，加入1mol/LH2S042ml；封管，l00℃水解8小时，然后加入BaC03中和，定量滤纸过滤，滤液留作分析。2．纸层析：将层析滤纸剪成7cm×40cm的纸条，距层析滤纸一端2cm处画一横线作为点样线,在点样线上画两个点分别作为标准糖溶液和多糖水解液的点样位置。用玻璃毛细管点样，斑点尽可能小，而且每点一滴，待点样点干燥后，在同一位置再点第二滴。然后将滤纸条悬挂于层析缸中进行层析，展层时间约为36小时。3．显色：将滤纸取出，自然干燥，喷上苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液，100℃条件下15分钟即可显色。标准单糖混合物色斑在滤纸上由下而上的顺序是：半乳糖-葡萄糖-甘露糖-阿拉伯糖。与标准单糖混合物色斑比较，即可判断多糖样品的单糖组成。三、糖链的序列测定（一）高碘酸氧化【实验原理】高碘酸可以选择性地氧化和断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量地进行，每开裂—个C-C键消耗一分子高碘酸。通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断多糖分子中糖苷键的位置、类型、多糖的分枝数目和取代情况等。【实验材料】1.实验器材紫外分光光度计。2.实验试剂(1)溴甲酚蓝指示剂:0.1克溴甲酚蓝溶于250ml蒸馏水中（含1.43毫升0.1mol/L氢氧化钠）。(2)30mmol/L高碘酸钠溶液。(3)乙二醇。(4)0.01mol/L氢氧化钠溶液。【实验操作】1.制作标准曲线：取6支干燥试管，按下表操作管号012345高碘酸钠（ml）00.51.01.52.04.0蒸馏水（ml）4.03.53.02.52.00各取0.1ml，定容至25ml，在223nm处测定光密度A223横坐标为高碘酸钠毫摩尔数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。2.样品测定称取多糖样品25mg，用少量水溶解，加入30mmol/L高碘酸钠溶液,定容至25ml，置于暗处,室温下进行反应，于0，6，12，24，36，48…小时间隔取样0.1ml，蒸馏水稀释250倍后，使用紫外分光光度计在223nm处测定光密度。至光密度值达一稳定值时，加乙二醇破坏过量的高碘酸以终止反应。由此光密度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量。取2ml上述反应溶液，测定甲酸的生成量。剩余部分进行Smith降解。3.甲酸测定：取2ml上述反应溶液，加一滴溴甲酚蓝作指示剂，用0.01mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸的释放量。【注意事项】为避免发生超氧化，反应溶液的pH值应控制在3~5，而且一定要在低温、避光处进行。（二）Smith降解【实验原理】Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物(如硼氢化钾或硼氢化钠)还原成稳定的多羟基化合物，然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产物可以推断多糖各组分的连接方式及次序。以葡聚糖为例，其反应式如下图：以1→2位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放；Smith降解后产生甘油。以1→4位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放；Smith降解后产生赤藓醇。以1→3位键和的糖基不被高碘酸氧化；Smith降解后仍为原来糖。以1→6位键和的糖基或非还原末端基（1→）经高碘酸氧化，消耗二分子高碘酸，同时释放一分子甲酸；Smith降解后产生甘油。本实验通过纸层析检测终产物中的甘油、赤藓醇和糖。【实验材料】0.1mol／L醋酸。2mol／L硫酸。硼氢化钾。纸层析试剂及器材：除显色剂外，同实验二。硝酸银显色剂：A:16%硝酸银水溶液:丙酮为1：9（V/V）。B:1%NaOH乙醇溶液(W/V)。C:6mol／L氢氧化铵。【实验操作】1.还原和水解高碘酸氧化后经乙二醇处理的溶液对流水透析48小时，蒸馏水透析24小时，于40℃以下减压浓缩至10ml左右，加入70mg硼氢化钾于室温、暗处搅拌18小时~24小时以还原多糖醛。用0.1mol／L醋酸中和至pH6~7，对流水透析48小时，蒸馏水透析24小时，减压蒸干，加1mol／L硫酸2ml，封管，100℃水解8小时，用碳酸钡粉末中和，定量滤纸过滤，滤液减压浓缩后，通过纸层析方法检测。2.纸层析操作详见实验2（单糖组成分析）。展层后，将滤纸取出，自然干燥，喷上试剂A，自然干燥，将滤纸浸入试剂B中，待斑点显出后，再浸入试剂C中以洗去滤纸上的氧化银，然后用水冲洗1小时左右，风干。以正丁醇：乙酸：水=4：l：5为展层剂时，甘油的Rf为：0.48，赤藓醇的Rf为：0.35。