多芳基取代蝶啶类化合物的合成及其抗肿瘤活性

13多芳基取代蝶啶类化合物的合成及其抗肿瘤活性黄金凤马林中山大学化学与化学工程学院有机化学研究所，广州510275摘要合成了一系列新的多芳基取代蝶啶类化合物，结构已经元素分析、IR,1HNMR和MS等确定。采用MTT法对这些化合物进行了体外的抗肿瘤活性测试，结果表明，它们对几种肿瘤细胞株都具有较好的抑制活性。它们可能是通过抑制二氢叶酸还原酶（DHFR）或其它叶酸依赖性酶而起抗肿瘤作用。关键词蝶啶合成抗肿瘤活性二氢叶酸还原酶（DHFR）蝶啶（Pteridines）是一种动物色素的总称，它们都具有一个嘧啶并吡嗪环（图1-a）的母体结构。最早是由英国科学家Hopkins于1896年从菜粉蝶的翅部获得的，因此被称为蝶啶。蝶啶类化合物广泛地存在于生物体中，例如叶酸（图1-b）。叶酸是天然生长素，是核酸生物合成的代谢物，也是红细胞发育生长的重要因子[1]，它参与由丝氨酸到甘氨酸，高半胱氨酸到甲硫氨酸的生物转化。正因为如此，叶酸成为引起药学界高度兴趣的有效结构形式。从上世纪50年代起，蝶啶类抗肿瘤药物引起了人们的高度重视。如最具代表性的甲氨蝶呤（MTX）[2]（图1-c）。NNNNHNNNNOH2NNHNHCOOHCOOHONNNNNH2H2NNNHCOOHCOOHOMeabc图1一些蝶啶化合物的结构MTX虽然是50年来唯一广泛应用于临床的叶酸拮抗剂类抗肿瘤药，但是它的细胞毒作用缺乏选择性，毒性大，抗瘤谱窄，并且抗药性严重。为此，本文在以往研究工作的基础上，在蝶啶的2位引入亲脂性的芳香基团,6位引入氮芥结构,设计并合成了几个新的蝶啶类化合物（Ⅰ~*基金项目中山大学化学与化工学院第三届创新化学实验基金项目（批准号：02003）资助第一作者黄金凤（1979年生），女，中山大学化学与化工学院材料化学专业99级指导老师马林Email：[e-mail]14Ⅲ），并对它们进行了抗肿瘤活性体外筛选实验。结果显示它们对几种肿瘤细胞株都具有较好的抑制活性。它们可能是通过抑制DHFR或其它叶酸依赖性酶而起抗肿瘤作用，进一步的研究还在进行之中。这类蝶啶化合物的具体合成路线如图2所示[3]。NNNH2NOR1NH2+CNNR22KCNNNNH2NNNH2NR22R1SOCl2+CHCl3NNNH2NNNH2N(CH2CH2Cl)2R190%EtOHⅠaR1=H,R2=HⅠbR1=CH3,R2=HⅠcR1=Cl,R2=HⅡaR1=H,R2=CH2CH2OHⅡbR1=CH3,R2=CH2CH2OHⅡcR1=Cl,R2=CH2CH2OHⅡa~cⅢaR1=HⅢbR1=CH3ⅢcR1=Cl图2其中嘧啶部分和苯乙腈部分的合成如图3所示[4-10]。CH2(CN)2+NaNO2+CH3COOHHO-N=C(CN)2AgNO3AgO-N=C(CN)2+-1NH2CNH.HClR1NNNH2NH2NOR1CH3OHCNH2NH2R1O-N=C(CN)2-+[]+Picoline3aR1=H3bR1=CH33cR1=Cl12aR1=H2bR1=CH32cR1=ClNO2CNCNCNNH2OCNN(CH2CH2OH)2HNO3-H2SO4FeNH4Cl25%HOAc456图31实验部分151.1试剂与仪器苯甲脒盐酸盐、4-甲基苯甲脒盐酸盐、4-氯苯甲脒盐酸盐、丙二腈、2-甲基吡啶、MTT（溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑）等均购自美国Aldrich公司，CT-DNA购自华美生物工程公司，其余试剂及溶剂均为国产市售分析纯，未进一步处理。熔点用北京泰克仪器公司的双目镜XT-4型显微熔点测定仪测定（温度计未经正），红外光谱Bruker公司的EQUINOX55型红外仪测定（KBr压片），核磁共振谱用VarianUnityINOVA500型核磁仪测定（TMS为内标，CDCl3或CD3OD或d6-DMSO为溶剂），质谱用VGZAB-HS质谱仪测定（FAB）,元素分析用ElementarVarioEL元素分析仪测定.1.2肟基丙二腈及其银盐（1）的合成[4]在一500mL烧瓶中加入25g（0.38mol）丙二腈，30mL水，120mL冰醋酸，在冰盐浴冷却（约-10℃）并搅拌下分批加入50g（0.72mol）NaNO2，约0.5h加完（反应温度控制在0~10℃之间）。加完后继续在5℃以下搅拌反应4h，得到橙红色溶液。搅拌下慢慢往此溶液中加入53g（0.312mol）AgNO3溶于100mL水的溶液，立即有橙黄色沉淀生成。加完后静置10min，滤集沉淀，水洗至中性，烘干，得到橙黄色固体产物1，重60g，收率为95.23%（以AgNO3计）。未进一步纯化，直接用于下面反应。1.34,6-二氨基-5-亚硝基嘧啶衍生物（3）的合成通法[5,6]将10mmol各种取代苯甲脒盐酸盐（2a~c）置于50mL圆底烧瓶中，加入30mL甲醇，室温搅拌下慢慢加入11mmol研成粉末的1，加完后继续搅拌1h，黄色的银盐渐渐消失，而产生白色的AgCl沉淀。滤去白色沉淀，用少量甲醇洗涤滤渣，合并滤液及洗液，得到一黄色溶液，此溶液在≤40℃下减压蒸出溶剂，得到黄色针状晶体。将此晶体置于50mL圆底烧瓶中，加入10mL2-甲基吡啶，加热125~130℃环化，反应0.5h，反应液由黄色变为黄绿色，最后变为蓝绿色。冷至室温后加入60mL水，有蓝绿色沉淀析出，冷至10℃左右，过滤，用冰水洗涤至无吡啶味，烘干，得到蓝绿色固体产物3a~c。1.3.14,6-二氨基-5-亚硝基-2-苯基嘧啶（3a）蓝绿色固体3a，产率49.88%。1HNMR（CD3OD，500MHz）δ：8.43（d,2H），7.53（d,1H），7.43~7.46（m,2H）；MS（FAB）m/z：216（M+1）+。1.3.24,6-二氨基-5-亚硝基-2-(4-甲基)苯基嘧啶（3b）蓝绿色固体3b，产率51.55%。MS（ESI）m/z：230（M+1）+。1.3.34,6-二氨基-5-亚硝基-2-(4-氯)苯基嘧啶（3c）蓝绿色固体3c，产率62.23%。MS（ESI）m/z：250（M+1）+:252（M+3）+=3:1。1.4对硝基苯乙腈（4）的合成[7,8]将50mL浓HNO3和50mL浓H2SO4混合后冷至0℃，搅拌下滴入50g（0.427mol）苯乙腈，内温控制在0~5℃，约30min滴完，在10℃以下继续反应1h，将反应液倒入500mL冰水中，析出淡黄色固体，过滤，水洗至中性，得到粗产品，用95%乙醇重结晶，得淡黄色针状晶体产物4，重41g，产率59.25%，m.p.115~116℃（与文献值一致）。1.5对氨基苯乙腈（5）的合成[7]将16.22g（0.1mol）4、50mL50%乙醇溶液、20gNH4Cl加入到250mL的三颈瓶中，升温至回流。在机械搅拌下分批加入还原铁粉17g（0.3mol），加完后回流反应1h，加入1g活性炭进行脱色，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼，合并洗液及滤液，蒸出溶剂后加入50mL水，用1MNaOH溶液调PH值至9，用CHCl3萃取（50mL×3），合并有机层，用无水Na2SO4干燥。蒸出溶剂后柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯=6/1）得橙红色固体产物5，重12g，产率90.79%，m.p.40~43℃。1HNMR（CDCl3，500MHz）δ：7.08（d,2H），6.66（d,2H），3.62（s,2H）；MS（FAB）m/z：133（M+1）+，106（M-CN）+。161.64-（二-2’-羟乙基）氨基苯乙腈（6）的合成[9,10]将9.25g（70mmol）5溶于100mL25%的醋酸中，在冰浴冷却下滴入9.25g（210mmol）环氧乙烷，滴完后，室温搅拌反应5h，加入饱和NaHCO3溶液调PH值至8（NaHCO3稍过量），用CHCl3萃取（50mL×3），合并有机层，用无水Na2SO4干燥。蒸出溶剂后柱层析分离纯化（纯CHCl3）得橙色低熔点固体产物6，重11.5g，产率74.58%。1HNMR（CDCl3，500MHz）δ：7.17（d,2H），6.73（d,2H），3.86（t,4H），3.65（s,2H），3.60（t,4H）；MS（FAB）m/z：221（M+1）＋，189（M-CH2OH）＋。1.74,7-二-氨基-2,6-二取代苯基蝶啶（Ⅰa~c、Ⅱa~c）的合成通法[3]将2mmol3a~c、5mmol4或5、5mmolKCN及40mL90%EtOH回流反应3h，反应液由蓝绿色变为黄绿色，最后变为棕黄（棕红）色，且有固体析出，静置冷却后滤集固体，水洗，干燥后柱层析分离纯化（CHCl3/CH3OH=10/1），得到产物Ⅰa~c、Ⅱa~c。1.7.14,7-二-氨基-6-（4-氨基）苯基-2-苯基蝶啶（Ⅰa）浅棕黄色固体Ⅰa，产率63.75%，m.p.＞300℃。1HNMR（DMSO-d6，500MHz）：6.70（d,2H），7.51~7.54（m,3H），7.62（d,2H），8.34（d,2H）；IRvmax/cm-1：3457.6,3055.7,1627.6,1557.0,1536.5,1441.2,1401.5,1338.4；MS（ESI）m/z：330（M+1）＋；元素分析（C18H15N7，w/%，括号里为理论值）：C65.50（65.64），H4.62（4.59），N29.65（29.77）。1.7.24,7-二-氨基-6-（4-氨基）苯基-2-（4-甲基）苯基蝶啶（Ⅰb）浅棕黄色固体Ⅰb，产率64.06%，m.p.＞300℃。1HNMR（DMSO-d6，500MHz）：2.35（s,3H），6.69（d,J=9.0Hz,2H），7.27（d,2H），7.58（d,2H），8.30（d,2H）；IRvmax/cm-1：3455.2,3059.9,1625.5,1536.5,1430.7,1403.5,1338.3,1264.6；MS（ESI）m/z：344（M+1）+；元素分析（C19H17N7，w/%，括号里为理论值）：C66.40（66.46），H5.07（4.99），N28.40（28.55）。1.7.34,7-二-氨基-6-（4-氨基）苯基-2-（4-氯）苯基蝶啶（Ⅰc）浅棕黄色固体Ⅰc，产率68.71%，m.p.＞300℃。1HNMR（DMSO-d6，500MHz）：6.69（d,2H），7.53（d,2H），7.59（d,2H），8.40（d,2H）；IRvmax/cm-1：3451.8,3060.7,1625.7,1537.7,1432.6,1339.8,1269.1；MS（ESI）m/z：364（M+1）+:366（M+3）+=3:1；元素分析（C18H14ClN7，w/%，括号里为理论值）：C59.24（59.43），H3.93（3.88），N26.81（26.95）。1.7.44,7-二-氨基-6-[4-二（2-羟乙基）氨基]苯基-2-苯基蝶啶（Ⅱa）橙红色固体Ⅱa，产率71.86%，m.p.276~277℃。1HNMR（CD3OD，500MHz）：3.64（t,4H），3.79（t,4H），6.91（d,2H），7.46~7.48（m,3H），7.71（d,2H），8.37（d,2H）；IRvmax/cm-1：3451.0,3290.4，3063.3，2952.0，2880.0，1607.4，1531.9，1442.2，1398.0；MS（FAB）m/z：418（M+1）＋；元素分析（C22H23N7O2，w/%，括号里为理论值）：C63.10（63.30），H5.62（5.55），N23.35（23.49）。1.7.54,7-二-氨基-6-[4-二（2-羟乙基）氨基]苯基-2-（4-甲基）苯基蝶啶（Ⅱb）浅棕黄色固体Ⅱb，产率60.30%，m.p.264~266℃。1HNMR（DMSO-d6，500MHz）：2.38（s,3H），3.51（t,4H），3.59（t,4H），6.81（