固相微萃取与顶空进样技术在食品分析中的应用.

固相微萃取与顶空进样技术在食品分析中的应用胡国栋中国食品发酵工业研究院食品分析的目标◆理化与感官质量的检验◆与品质相关的特征组分分析◆与安全相关的卫生质量的监测食品样品传统制备方法的复杂性◆传统的制备方法：液-液萃取、索氏萃取、蒸馏等◆步骤多、耗时长、可靠性差，大量耗费有机溶剂，环境污染严重◆探寻更为简捷、有效的食品样品制备方法是分析化学面临的任务食品样品处理的新技术无溶剂（或少溶剂）的处理技术已成为食品样品制备的主要发展方向，目前比较成熟的技术包括：以吸附剂萃取为基础的固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)；以气体萃取为基础的顶空分析(HS)，包括静态顶空(StaticHeadspace)与动态顶空(DynamicHeadspace)；超临界流体萃取等“固相微萃取技术”的由来固相微萃取技术（solid-phasemicroextraction,SPME）是1990年由加拿大学者Pawliszyn和他的合作者首创，并于近10余年间迅速发展和完善的样品制备新技术。SPME的原理SPME是依据有机化合物能吸附在涂于石英细丝表面的色谱固定相上，且被吸附的分析物在GC的进样口遇热可定量解吸的原理而设计的技术。依据类似的原理，HPLC流动相将分析物冲洗到液相色谱柱中，SPME也可用于HPLC分析。SPME的三种不同萃取方式纤维针式固相微萃取（FiberSPME）这是最常用的供GC分析进样的SPME萃取方式管内固相微萃取（In-tubeSPME）富集倍数有所提高，主要供HPLC分析搅拌棒吸附萃取（SBSE）富集倍数大大超过前两种方式，适合痕量组分分析，由德国Gerstel公司实现商品化SPME的装置主要由萃取头（Fiber）和手柄（Holder）两部分组成，其状形同一支色谱注射器，萃取头是一根长度仅为1cm的熔融石英丝，其表面涂有厚膜的色谱固定相或吸附剂。由Supelco公司设计的SPME装置供GC进样的SPME装置示意图固相微萃取技术的特点◆摒弃了传统的溶剂，并将萃取、浓缩、解吸、进样集于一体◆高灵敏度，通常LOD可达ppb或ppt◆将分析对象从挥发性物质延伸到难挥发物质◆操作简单、费用低SPME定量对测定条件的要求萃取头的极性和涂层厚度，取样方式（顶空或浸入），样品pH值和加盐量，样品恒温温度和萃取时间，搅拌状况，样品瓶中溶液与顶空的体积比例，乃至取样时萃取头与液面的距离等参数均需通过实验确定，并在以后的测定中严格保持一致，方可获得重复的测定结果。各类商品萃取头的性能比较萃取头的选择SPME与其它萃取方法一样，同样遵循“相似相溶”的原则，如同毛细管色谱柱的选择，没有一种萃取头能萃取所有的化合物。涂层的极性与厚度必须与分析物的性质匹配，极性较强的涂层（如PA萃取头）适合萃取极性化合物，而非极性的PDMS萃取头则主要用于非极性化合物的萃取。萃取头涂层对于分析物要有较强的萃取能力，能在较短时间内达到吸附平衡，热解吸时分析物能迅速从萃取头上解吸，由于解吸通常在高温下进行，因此，所选萃取头必须有良好的热稳定性。搅拌棒吸附萃取搅拌棒吸附萃取（SBSE)是1999年出现的一种新型的固相微萃取方法。在萃取过程中，外面涂有聚二甲基硅氧烷涂层的搅拌子在水相基质中不断吸附低浓度的分析物，从而起到浓缩作用。SBSE与传统的SPME方法相比，灵敏度可以提高1－2个数量级。德国Gerstel公司推出了商品化的搅拌棒“Twister”，已经在众多的分析研究中得到了应用。搅拌棒吸附萃取的特点SBSE萃取相的体积通常为55-250μL，比纤维针式固相微萃取（FiberSPME）的萃取相体积0.5-1μL和管内固相微萃取（In-tubeSPME）的2-20μL大得多，相应提高了富集倍数，因此更适合于样品中痕量组分的分析。但由于它需要专用的热脱附装置，同时，为了避免组分峰在色谱柱上的扩宽，还需要柱头的冷聚焦装置，因此装置比较贵，操作也比较复杂。固相微萃取在食品风味质量控制分析中的应用◆水果和果汁的分析●新鲜原料的香味组成，加工过程及储存后的变化◆酒类的微量香味组分分析●采用HS—SPME分析◆油脂氧化变质后产生的不良风味分析●变质玉米油采用HS—SPME分析果汁香味组分的SPME分析谱图采用SPME定量分析啤酒样品的典型色谱图1.乙醛,2.乙酸乙酯,3.乙酸异丁酯,4.正丙醇,5.异丁醇,6.乙酸异戊酯,7.4-甲基-2-戊醇（内标）,8.异戊醇,9.己酸乙酯,10.辛酸乙酯,11.乙酸,12.里哪醇,13癸酸乙酯,14.异戊酸,15.乙酸苯乙酯,16.己酸,17.-苯乙醇,18.辛酸,19.癸酸引自胡国栋等，第十四次全国色谱学术报告会文集，无锡，2003.482-484.12345678910111213141516171819-0.800.81.62.43.244.85.66.47.2mV691215182124273033min2003年，我们再度优化了各种操作条件，以GC/MS和GC获得了啤酒41种香味化合物确切定性结果,它包括14种酯类、12种醇类、8种酸类、3种醛类、2种酚类、1种含硫化合物和1种含氧杂环化合物。酯类：乙酸乙酯，乙酸异丁酯，乙酸异戊酯，己酸乙酯，乙酸己酯，乳酸乙酯，辛酸乙酯，乙酸辛酯，癸酸乙酯，苯乙酸乙酯，乙酸苯乙酯，月桂酸乙酯，丁酸-β-苯乙酯，邻苯二甲酸二异丁酯醇类：正丙醇，异丁醇，异戊醇，正己醇，2-乙基-1-己醇，里哪醇，正辛醇，糠醇，α-萜品醇，香茅醇，β-苯乙醇，月桂醇酸类：乙酸，异丁酸，异戊酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，2-乙基己酸醛类：乙醛，癸醛，糠醛酚类：苯酚，4-乙烯基愈疮木酚含硫化合物：3-甲硫基-1-丙醇含氧杂环化合物：二氢-5-戊基-2(3H)-呋喃酮引自胡国栋等食品与发酵工业，2004，30（2）：1-5.采用SPME测定啤酒中含量为ppb量级的酒花香组分14.0015.0016.0017.0018.0019.0020.0021.0022.0023.0024.001000002000003000004000005000006000007000008000009000001000000110000012000001300000140000015000001600000Time--AbundanceTIC:5-24(5-211PCH-SH).D\data.ms987654321啤酒中酒花香组分（上）总离子流图（下）选择离子流图1.里哪醇；2.萜品烯-4-醇（内标）；3.乙酸香茅酯；4.香叶酸甲酯；5.α-萜品醇；6.乙酸香叶酯7.β-香茅醇；8.香叶醇；9.反式-橙花叔醇引自王憬等，食品与发酵工业，2007，33(8):12814.0015.0016.0017.0018.0019.0020.0021.0022.0023.00500010000150002000025000300003500040000Time--AbundanceTIC:5-11(5-214B11PCHSH-2).D\data.ms965432178HS-SPME在葡萄酒风味分析中的应用HS-SPME在苹果酒风味分析中的应用采用SPME分析苹果的香气组分分析苹果香气的相应测定条件（续）通过SPME测定监控牛奶的风味变化牛奶的HS-SPME-GC/MS分析条件SPME测定杀菌方式引起的牛奶挥发性组分的变化SPME测定杀菌方式引起的牛奶挥发性组分的变化（续）主成分分析法（PCA）处理从SPME分析所获数据PA、PBPasteurizedmilkUHTA、UHTBUHTmilkGroup2,3SamplessubmittedtothehighestlevelofheatandpressureTreatment引自JAgricFoodChem,2006,54(24):9190Cheese的SPME分析变质的玉米油SPME分析谱图固相微萃取在食品安全监测中的应用从1994年首次将SPME应用于农药残留的分析起，已有十余年的经历。目前，应用固相微萃取作残留分析的农药主要是各类杀虫剂，包括有机氯、有机磷及氨基甲酸酯等，也可用于少数除草剂的检测。样品的对象以液体最为适合，如水样和各种酒类，随着微波辅助萃取与固相微萃取的结合使用，使这一技术也可用于复杂基质的固体样品的测定。SPME测定葡萄酒中的有机磷、有机氯农药残留SPME测定葡萄酒中的有机磷、有机氯农药残留（续）方法要点：100μPDMS萃取头，于45℃、3mL酒液中，浸入式萃取30min,请见JournalofChromatographyA2000，889(1-2):59-67MAE-SPME-GC测定茶叶中的有机氯和拟除虫菊酯农药残留红葡萄酒中有机磷农药的检测草莓农药残留的SPME分析谱图采用SPME作定量分析时必须注意的问题固相微萃取不同于传统的液体进样方法，它对不同化合物的萃取率差异非常大，有时不同碳数的同类化合物能相差许多倍，至于不同类别的化合物，校正因子的差异更大到2－3个数量级，因此，组分的定量测定切不可以采取面积归一化方法，而必须采用标样作校正。当然在作方法条件试验时，作为方法的相对比较，归一化法还是可以用的。采用SPME作定量分析时必须注意的问题（续）以啤酒的香味组分分析为例，采用PA萃取头，以啤酒基质通过添加标样的方式并以内标法测定组分的校正因子，其相互之间的差别非常大：若以乙酸乙酯为1，则己酸乙酯为118，辛酸乙酯为469，癸酸乙酯的灵敏度最高，达530，而在同一条件下，乙酸仅为0.05。尽管这一差别随萃取头及萃取条件而异，但国外文献提供的回归方程都可说明这一点。国内的一些研究者常常简单地以“峰面积归一化”结果作为“含量”报告，这是SPME定量测定中极待注意的问题。采用SPME作定量分析时必须注意的问题（续2）左表引自AmJEnolVitic,2005,56(1):37-45作者以乙醇水溶液为基质通过添加标样的方式测定组分的校正因子，其相互之间的差别与我们测定的啤酒情况类似：若以乙酸乙酯为1，则丁酸乙酯为18、己酸乙酯为183、辛酸乙酯为463，癸酸乙酯的灵敏度稍低，为232。小结SPME是近10余年间迅速发展和完善的样品制备新技术，它将萃取、浓缩、进样集于一体，灵敏度高且操作简便。SPME在食品分析中的成功应用为产品的质量控制分析技术向深层目标发展奠定了技术基础。本文介绍的国内外应用示例表明，它的应用前景十分广阔。SPME用于复杂产物的定性研究时，与其它提取方法相比具有明显优势。但由于组分的色谱峰面积受样品基质的影响特别严重，因此，定量测定时必须采用标样作校正，并且尽量选择合适的内标物，采用内标法定量。切忌简单地以峰面积归一化结果表述为“定量结果”。顶空气相色谱法的概述顶空气相色谱法（HS-GC）是一种以分析置于密闭容器中样品上方的蒸气组成为基础的气相色谱分析法。顶空气相色谱法适合于分析样品中较易挥发的组分。对于含固型物较多的液体样品或固体样品，由于其不能直接进样进行气相色谱分析，而采用顶空气相色谱法则是操作简便、快速分析样品中较易挥发的组分的一种好方法，因此，顶空气相色谱法在环保、药物、石化等领域成为重要的分析手段，在食品分析方面也得到了广泛的应用。顶空气相色谱法的应用对象顶空气相色谱法分为静态法和动态法（又名吹扫－捕集法）静态顶空进样法(StaticHeadspace)置于密闭容器中的样品在一定的温度下与其上方的蒸气达到平衡后，采用适当的方法抽取顶空气以供气相色谱分析。按照进样方式的不同，静态顶空进样可以分为：手动进样（采用气密性注射器进样）与自动进样（采用与GC相连的专用仪器进样）静态顶空气相色谱的进样方式手动进样的静态顶空气相色谱采用手动进样的静态顶空色谱装置比较简单，只要有一台控温精确的恒温水浴和气密性注射器就可以试验。但由于压力控制难以实现，又受到取样与进样过程中温度变化等一系列可变因素的制约，分析的重现性无法与自动进样装置相比，只适合作定性试验不宜用作定量测定。自动进样的静态顶空气相色谱目前，商品化的自动