大肠杆菌BL21感受态的制备和保存方法研究

大肠杆菌BL21感受态的制备和保存方法研究焦亮（细胞生物学2009111107000732）[摘要]目的：描述一种改良的大肠杆菌感受态制备和保藏及质粒的转化方法．方法：将CaCl2溶液改为TB溶液；其次是将培养基由LB换成NZY，并分别比较了不同冷冻保护剂(7%DMSO，10％甘油)于－20℃、－80℃冰箱保存感受态细胞的效果。结果：以TB溶液制备感受态细胞，冰浴转化10min后直接涂平板筛选转化子，获得与常规转化方法相当的转化效率,而以7％的DMSO为冷冻保护剂保存感受态细胞可维持107以上的转化率40d以上。[关键词]大肠杆菌；感受态细胞；制备方法；转化率；保存StudyonPreparationandStorageofCompetentEscherichiacoliBL21CellsJiaoLiang[Abstract]Objective:AnefficientmethodwasdescribedfortheE.colipreparation，storageandplasmidtransformation.Methods:Normalconditionswerechanged,fromCaCl2solutiontoTBsolution,LBmediumtoNZYmediumandcompareddifferentconditionsforstorageofcompetentcells.Results:HightransformationefficiencywasachievedbypreparingthecompetentcellswithTBsolution,transformingfor10minutes,andthenfollowingthedirectselectiononAmp+LBplate,andCellsstoredwithdimethylsulfoxidein-80℃couldkeepconsistentlyhightransformationefficiencyatleast40d.[Keywords]competentcells;Escherichiacoli;Preparation;storage大肠杆菌感受态细胞的制备是实验室分子克隆的重要试验之一，在实际操作中，由于感受态细胞的转化效率受到诸多因素的影响，如离子强度、热击参数、培养条件、保存温度及时间等，转化效率很不稳定。很多实验室采取不同的方法来提高感受态细胞的转化效率，但由于这些方法重复率性差，应用并不普遍。本文总结出一种制备大肠杆菌高效感受态细胞的方法并优化了高效感受态保存的方法。1材料与方法1.1材料E.coliBL21由湖北大学分子生物实验室保存；质粒pet23a-his-RECQL为湖北大学分子生物实验室构建。细菌培养基：LB固体培养基和NZY液体培养基参考文献[1]TB(CaCl2)溶液：Pipes3.021g/L,CaCl2·2H2O2.205g/L,KCL18.637g/L,MnCl2·4H2O10.885g/L.所有成分除了MnCl2外被混合并且KOH将PH值调至6.7。然后将MnCl2溶解，溶液通过0.45μm的过滤器过滤灭菌并于4℃存储；DMSO（二甲基亚砜）1.2方法1.2.1标准质粒制备：常规碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分析仪下观察，将显示为超螺旋DNA带型的凝胶切下．胶回收后电泳确保质粒全部为超螺旋状态．紫外分光光度计测其纯度及浓度，TE稀释为1ng／μl，存于-20℃备用.1.2.2大肠杆菌感受态细胞的制备。将大肠杆菌E.coliBL21划线接种于LB固体培养基平皿上，于37℃下倒置培养16-18h；将单菌落接种于装有100mlNZY培养液的500ml三角瓶中，18℃下振荡培养至光密度OD600值0.8-0.9，将三角瓶在冰上放置10min；然后将菌液转移至离心管中4800r/min离心10min，去上清，回收细胞；用冰冷的TB溶液悬浮细胞，立即置冰上放30min；于4℃条件下4800r/min离心7min，回收细胞；用冰冷的TB溶液6ml悬浮细胞，保存备用。1.2.3转化及转化率测定：参考文献[2]。转化率即每微克DNA转化后所产生的单菌落个数。1.2.4贮存方法：新鲜制备的感受态细胞，分批加入终浓度7%DMSO、10%甘油，分装后，分别于-80℃和-20℃冰箱贮存。每周检测转化率1次。2结果与分析2.1培养皿内菌落生长状态转化试验组含抗菌素平板上长出的菌落即为转化体，质粒对照组无受体菌，质粒DNA不能单独存活，不长出菌落；受体菌对照组在不含抗菌素平板上有大量菌落长出，在含抗菌素平板上无菌落长出，是因为E.coliBL21在含抗生素的培养基上不能生长，说明该试验未产生抗药性突变株；而转化试验组在两种条件下都能长出菌落，是因为质粒DNA具有抗药性(表1)。2.2不同贮存方法对转化率的影响如图所示，-80℃保存效果明显优于-20℃保存，二者至少相差1个数量级（见图3-6）；DMSO的保存效果优于甘油，用DMSO作为冷冻保存剂贮存于-80℃超低温冰箱的感受态细胞在40多天后仍能保持1.68×107的转化率（见图7），而用甘油作为冷冻剂贮存于-80℃的感受态细胞一周后已由1.9×107下降至6×106（图6、8）3讨论本实验中，TB溶液制备的感受态细胞，冰浴10min转化质粒后直接涂平板选择转化子，可获得快速、高效的转化效果。我们所建立的快速质粒转化方法，与常规质粒转化方法相比，省去了在冰浴上放置0.5h，热激后在培养1h，只需将质粒和感受态细胞在冰浴上混匀后放置10min左右，然后直接铺在平板上，缩短了时间并提高转化效率。DMSO的保存效果优于甘油。可能是因为DMSO分子量（78.14）较甘油（92.10）小，能更快地计入细胞膜，与磷脂发生静电反应，提高膜的也太流动性，降低膜脂质的相变温度，从而增加生物膜对渗透压和细胞皱缩的耐受性，保护了冷冻和解冻过程中细胞膜的稳定性。同时，DMSO也可诱导细胞膜上的某些特殊的物质用于其微孔的形成，减少运输阻力，更有利于质粒DNA进入。而甘油进入细胞膜所需时间较长，且毒性较DMSO大，对感受态细胞的转化率也有影响。另外，在本试验中，-80℃超低温冰箱的冷冻保存效果优于-20℃冰箱，可能由于-20℃只是使细胞处于过冷状态，其对冷冻保护剂的损害还较敏感；而在超低温保存时，细胞处于休眠状态，可能更能承受冷冻、化冻和保护剂的伤害。将感受态细胞用7%DMSO作为冷冻保护剂保存于-80℃时效果较好，可维持在lO7以上的转化率达一个多月。参考文献：[1]J萨姆布鲁克，DW拉塞尔著．黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等译．分子克隆试验指南[M],第3版，北京；科学出版社，2002，8.87-96[2]卢圣栋．现代分子生物学实验技术[M]．北京：中国协和医科大学出版社，1999，12.290—293．[3]InoueH,NojimaH,OkaymaH,HighefficiencytransformationofEscherichiacoliwithplasmids[J],Gene,1990,96:23-28[4]TsenSD.NaturalplasmidtransformationinE.coli[J].Biomed.Sci,2002,9:246-252.[5]柯涛，张勇法，潘园园，等．温度对大肠杆菌感受态细胞的影响[J]．河南农业大学学报，20O3，37(1)：57—60．[6]FinkelSE.KolterR.DNAasanutrient:novelroleforgenehomologs[J].Bacterial,2002,183:6288-6293.