大肠杆菌SPA的提取表达及鉴定

1SPA的提取、表达及鉴定班级：08级生物技术试验班学号：................姓名：指导老师：...........时间:2010年9月13日～11月19日2目录§1前言（背景介绍）............................................................................................31.1SPA介绍.......................................................................................................31.2实验原理.............................................................../......................................5§2材料与方法........................................................................................................72.1实验材料.......................................................................................................72.2实验方法.......................................................................................................82.2.1试剂的配制、灭菌及无菌接种.........................................................82.2.2蛋白的提取......................................................................................92.2.3SDS-PAGE检测表达的蛋白质..........................................................102.2.4westernblotting..........................................................................11§3实验结果与讨论..............................................................................................123.1结果汇总.....................................................................................................123.2结果讨论.....................................................................................................133.3注意事项.....................................................................................................14参考文献................................................................................................................153§1前言1.1SPA介绍1.1.1SPA简介金黄色葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalProteinA、简称SPA)是细胞壁抗原的主要成分，几乎90%以上的菌株均含有这种成分，但不同的菌株含量差别十分悬殊。SPA占整个细胞壁蛋白成分的6.7%，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA。1.1.2SPA的理化性质SPA是一种蛋白质,由亮、缬、脯、丙、苏、甘、丝、谷丙、天门冬及赖氨酸等十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275nm%=1.65，等电点为pH5.1。SPA十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。其分子量因测定方法不同而有所差异。1.1.3SPA的免疫学性质Spa能与人以及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合,结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、猴、小鼠、及牛；对马、犊牛、山羊等无亲和力：对所有的鱼类、两栖类、爬行类、鸟类（除少数例外）均不结合，结婚的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。研究表明：IgG与APS的结合部位是CH2和CH3的交界处,这种结合不会影响免疫蛋白的活性。1.1.4SPA的生物学特性1．免疫原性与过敏原性SPA做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成Ig，又能与其相应抗体的Fab段结合呈现抗原抗体的特异性反应。SPA－IgG注射家兔皮下可引起Arthus样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。SPA体外试验，能刺激豚鼠离体回肠收缩。2．抗吞噬作用由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点，又是SPA反应点。因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作4用，也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。3．固定补体SPA－IgG和免疫复合物一样可以固定人和某些动物(如豚鼠、猪、狗等)血清中的补体，主要是通过补体传统激活途径。4．促有丝分裂因子SPA是一种B细胞激活剂，固相SPA作用明显，并不需要T细胞辅助,可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与。5．去封闭作用固相SPA能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。1.1.5SPA的应用SPA应用很广，但所有应用的原理都离不开SPA具有与IgG的Fc段的结合能力，主要应用方面如下：1．SPA菌的协同凝集作用：用已知的标准血清，吸附到SPA菌的表面,使之成为吸附抗体的载体,再以此去诊断相应的未知抗原而产生肉眼可见的凝集颗粒,诊断的抗原可以是颗粒性的,也可以是可溶性的。此种凝集相当于反向间接血凝,但省去间接血凝中的抗体纯化,红血球鞣化等复杂手续,而只需要SPA菌体及粗制免疫血清即可。所以此法简单、快速,特异性敏感性均较满意。目前已用于许多细胞和病毒的检测及分型。2.作为广谱第二抗体：用SPA代替抗体IgG的第二抗体，有如下优点：①SPA制备容易，性质稳定，易纯化，对人和多种哺乳动物的IgG都能应用,不受种属限制。而第二抗体的制备比较麻烦，且需多次免疫动物，在应用上要受同种属的限制；②SPA的结合力强，相当于游离抗体与抗原的结合力，对人和兔的亲和常数均为103L/克分子，结合后对IgG的活性无影响。无论在0℃、37℃、44℃及56℃几乎均能立即结合而无需长时间的孵育，因此可以缩短试验时间，第二抗体在较长的孵育中，出现抗原分解的问题也可以得到解决；③SPA容易标上125I、荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白等，因此可与多种技术相结合；④在检查细胞上的病毒抗原时，第二抗体往往特异性不强，会非特异性地与细胞膜上的Fc受体结合。SPA分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受Fc受体影响，所以有较高的抗IgG特异性；⑤用第二抗体做免疫沉淀试验时，必须将抗免疫球蛋白的浓度调整至等价，才能产生最佳的沉淀作用。而用SPA菌沉淀，不受此5限制，能保证彻底的沉淀；⑥SPA与lgG结合是可逆的，用4mol/L尿素、4mol/L硫氰酸、盐酸(pH2.5)或鸟嘌呤盐酸盐等都可以使之重新解离。3.用于提取纯化IgG利用SPA与IgG的结合特性提取IgG，比常规采用硫酸铵、Sephadex柱，DEAE柱或免疫梯度离心等法要简便得多，而且纯度好。4.检测和提纯IgMIgM在病毒的早期诊断中具有重要意义，为了检测特异性IgM抗体，必须首先在血清中除去IgG。采用SPA菌吸附IgG是目前快速而又理想的办法，利用此法也为IgM的提纯开辟了道路。5.其它方面：用于免疫复合物的检测、体外激活补体功能试验、细胞表面标记以及肿瘤表面抗原的检测以及免疫电镜上的应用等。1.2实验原理1.2.1蛋白的提取与纯化IMAC(ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography)是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986年Porathetal.还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。1.2.2SDS-PAGE检测表达的蛋白质6蛋白质分子是两性电解质分子，在直流电场内可以移动，PAGE过程中具有三种物理效应：1.凝胶对样品分子的筛选效应（分子筛效应）颗粒小、呈球形的样品分子移动快，颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶孔洞时的阻力大，移动慢。2.不连续系统对样品的浓缩效应:⑴凝胶层的不连续：浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小，在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时的阻力小，移动快，而在小孔径中，移动慢。因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。⑵缓冲液离子成分及pH的不连续：在两层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷（Tris）及HCI。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子，HCI在任何pH值溶液中均易解离出氯离子，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸（Gly）在pH8.3的缓冲液中其解离度很小，仅为0.1％－1％，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。血清中，大多数蛋白质等电点在5.0左右，在pH8.3或6.7时均带负电荷，在电场中移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面出，被浓缩成极窄的区带。三者的有效迁移率为m氯α氯m蛋白α蛋白m甘α甘（m为迁移率，α为解离度），当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子及甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分成多个区带，因此分离胶之间pH的不连续性可控制其迁移率。在浓缩胶中要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品在快慢界面之间被浓缩。进入分离胶后，慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。⑶电位梯度的不连续性：电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关。电泳开始后由于快离子迁移率大，就会很快超