大花君子兰总生物碱抗肿瘤作用的研究(20黑体)

大花君子兰总生物碱抗肿瘤作用的研究*(20黑体)于妮娜，包海鹰**，何忠梅(4号仿宋)吉林农业大学中药材学院，长春130118（５号楷体）摘要（小五黑体）：采用MTT法观察大花君子兰总生物碱（简写为TACMR）对体外培养的人肺癌细胞NCI-H446、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞SMMC-77214种细胞株的增殖抑制作用；用小鼠移植性肿瘤法检测TACMR对小鼠H22肝癌的生长抑制作用，并通过脾指数和胸腺指数等指标综合考察TACMR对肿瘤小鼠免疫机能的影响。体外MTT结果显示：TACMR对NCI-H446、SGC-7901、MCF-7和SMMC-7721均具有明显的细胞增殖抑制作用，且均呈现良好的量效关系，并且TACMR作用于4种不同人肿瘤细胞48h的IC50值分别为38.55，12.08，8.85，7.04μg/mL；体内试验结果表明，TACMR对H22肝癌生长具有一定的抑制作用。TACMR剂量在34mg/kg时，抑瘤率为35.2%，脾指数与阳性对照组相比显著增加（P＜0.01）。TACMR剂量在136mg/kg时，抑瘤率仅为3.7%，与阴性对照组比较，胸腺指数和脾指数明显减少（P＜0.01），与阳性对照组比较，胸腺指数明显减少（P＜0.01）。上述体内外试验结果表明:TACMR具有抗肿瘤作用，同时对免疫功能有一定的影响。（９.５仿宋）关键词（小五黑体）：大花君子兰；总生物碱；MTT法；H22荷瘤小鼠（９.５仿宋）中图分类号（小五黑体）：文献标识码（小五黑体）：A文章编号（小五黑体）：1000-5684(2011)DOI（小五黑体）:网络出版地址（小五黑体）：Anti-TumorEffectofTotalAlkaloidsfromCliviaminiataRegel（小三号TimesNewRoman加粗）YUNi-na，BAOHai-ying，HEZhong-mei（１１号MicrosoftJhengHei）CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China（５号TimesNewRoman）Abstract（５号Arial）:Invitro,theinhibitoryeffectsoftotalalkaloidsfromCliviaminiataRegel(TACMR)onproliferationofNCI-H446,SGC-7901,MCF-7,andSMMC-7721weremeasuredbyMTTcolorimetricassay.TheinhibitoryeffectsofTACMRonH22hepaticcancerwasobservedinmicewithsubcutaneousinoculationonthetumorcellsanditseffectonimmunologicalfunctionofmicebearingtumorbyobservingtheinfluencetospleenindex,thymusindexandsoon.Invitro,theresultsofMTTshowedthatTACMRinhibitedproliferationofNCI-H446,SGC-7901,MCF-7,SMMC-7721andagooddose-effectrelationshipandtheIC50valuesonthemwere38.55,12.08,8.85and7.04μg/mL.Invivo,TACMRhassignificantinhibitoryeffectonH22tumorcells.Theinhibitionratiowas35.2%withthedosageof34mg/kg,comparedwiththepositivecontrolgroup,spleenindexincreasedsignificantly(P＜0.01).Theinhibitionratiowas3.7%withthedosageof136mg/kg,comparedwithnegativecontrolgroup,thymusindexandspleenindexdecreasedsignificantly(P＜0.01),comparedwiththepositivecontrolgroup,thymusindexdecreasedsignificantly(P＜0.01).Intumorinhibitorytest,itwasshownthatTACMRhasstronginhibitionontumorcellsandcertainimpactonimmunologicalfunction.（10号TimesNewRoman）Keywords（５号Arial）:CliviaminiataRegel;totalalkaloids;MTT;H22tumorbearingmice（10号TimesNewRoman）大花君子兰（CliviaminiataRegel.）为石蒜科(Amaryllidaceae)君子兰属（Clivia）多年生常绿草本植物，又名剑叶石蒜，大叶石蒜，达木兰。君子兰原产于南非，20世纪初传入中国，我国栽培的品种吉林农业大学学2011，[e-mail]*基金项目（小五黑体）：长春市惠宝君子兰科技养殖及药理活性研究项目（2010040101）（小五宋体）作者简介（小五黑体）：于妮娜，女，在读硕士，研究方向：生药学。（小五宋体）收稿日期（小五黑体）：2010-10-24网络出版时间（小五黑体）：**通讯作者（小五宋体）吉林农业大学学报2011年03月JournalofJilinAgriculturalUniversity2011，March以大花君子兰为主。吉林省长春市于1984年将君子兰定为长春市市花。君子兰含有生物碱类、花色苷类、黄酮类、氨基酸类、无机元素等多种化学成分[1-4]。近年来的研究表明，君子兰水提液具有强心、抗心律失常作用[5-6]。君子兰总生物碱具有抗菌、抗炎、抗氧化和保护肝肾的作用，同时可抑制小鼠肝癌实体瘤的生长[7-8]。从根和叶中分离得到的石蒜碱，具有抗病毒、抗癌、抗寄生虫和抗疟疾作用[9]。目前，对TACMR体外抗肿瘤作用及体内抗肿瘤对免疫系统的影响研究报道甚少。本研究采用MTT法观察TACMR对体外培养的人肺癌细胞NCI-H446、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞SMMC-77214种细胞株的增殖抑制作用；用小鼠移植性肿瘤法检测TACMR对小鼠H22肝癌的生长抑制作用，并通过脾指数和胸腺指数等指标综合考察TACMR对肿瘤小鼠免疫机能的影响，为更好的开发利用大花君子兰资源以及临床应用等提供理论依据。（10号宋体然后TimesNewRoman）1材料与方法（小四黑体）1.1供试材料（五号黑体）大花君子兰(CliviaminiataRegel.)，购自长春惠宝君子兰养殖基地，由吉林农业大学图力古尔教授鉴定。人肺癌细胞NCI-H446、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞SMMC-7721和小鼠H22肝癌瘤株，均由吉林省肿瘤医院提供。昆明小鼠，雌性，体重20±2g，购于吉林大学实验动物中心。1.2试剂与仪器CO2培养箱（NAPCO法国），酶标仪（芬兰Labsystems公司），注射用环磷酰胺(CTX，山西普德药业有限公司，产品批号20080602)，5-氟尿嘧啶（5-Fu，购于吉林省肿瘤医院），二甲基亚砜DMSO(Amersco)，胎牛血清（购于长春生物制品研究所），胰蛋白酶（购于上海化学试剂厂），四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司），离心机（美国SORVALL公司），KX-21N全自动血液分析仪（日本SYSMEX公司）。1.3TACMR的制备取大花君子兰根粉末1.5kg，用95%乙醇3000mL加热60℃回流提取8h，重复3次，合并提取液，过滤，减压浓缩至浸膏，然后用0.01mol/LHCl溶解，静置24h，取上清液，用等体积的氯仿反复萃取除去杂质，萃取后的酸水溶液用氨水调至pH10，用等体积的氯仿再次萃取，至与生物碱化学检识试剂碘化铋钾、碘化汞钾、硅钨酸反应均呈阴性。萃取液减压浓缩得黄色固体粉末，与生物碱化学检识试剂碘化铋钾、碘化汞钾、硅钨酸反应均呈阳性，即为TACMR，备用。1.4体外试验方法1.4.1细胞培养（五号楷体）将肿瘤细胞接种于含10%胎牛血清、100U/mL青链霉素的RPMI-1640培养液中，放入37℃、5%CO2培养箱培养，待细胞进入对数生长期后用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。1.4.2药物配制受试药分8个浓度，依次为200，100，50，25，12.5，6.25，3.12，1.56µg/mL；阳性药5-Fu浓度为25µg·mL-1。1.4.3MTT试验步骤将细胞以1×105个/mL浓度接种于96孔板，每孔100μL，37℃、5%CO2饱和湿度培养24h后，按设计浓度加受试药，每个剂量4个平行孔，每孔加药量100µL。再培养72h后，每孔加入MTT液20μL（浓度为5g·L-1），继续培养4h，弃去所有上清，每孔加150μLDMSO，微量振荡器振荡10min，置酶标仪上测定各孔在570nm波长处吸光度值。细胞增殖抑制率（%）=(阴性对照组A值-受试药组A值)/阴性对照组A值×100。药物的半数抑制量IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]，其中Xm为设计的最大浓度的对数值；i为各浓度倍比浓度的对数值；ΣP为各组生长抑制率之和；0.5为经验常数。1.5体内试验方法选择腹腔接种6~8d生长良好的H22肝癌小鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下抽取腹水，用生理盐水稀释成细胞个数为1×106/mL的细胞悬液，接种于小鼠右腋皮下，每只0.1mL。然后随机分成6组，即空白组，阴性对照组，阳性对照组，TACMR高、中、低剂量组，即136，68，34mg/kg（相当于LD50的1/25，1/50，1/100），每组10只。次日开始每天灌胃给药1次，连续12d。阳性对照组按20mg/kg浓度、每隔1d腹腔注射CTX，体积为0.1mL/10g。第13d颈椎脱臼处死小鼠，摘眼球取血0.5~1.0mL，抽取400μL血液，转移到真空抗凝管中，使用KX-21N全自动血液分析仪对白细胞数进行检测。将取血后小鼠处死，摘取瘤块、胸腺和脾，分别称重并计算抑瘤率和脾指数、胸腺指数。肿瘤抑制率=（阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/阴性对照组平均瘤重×100%。胸腺指数为每克体重中胸腺的毫克数，脾指数为每克体重中脾脏的毫克数。1.6统计方法测定指标采用x±s表示，所有数据由SPSS18.0统计软件进行One-WayANOVA分析，并计算相应的统计学参数。2结果2.1TACMR对体外培养的4种不同人肿瘤细胞增殖的影响于妮娜等：大花君子兰总生物碱抗肿瘤作用的研究吉林农业大学学报JournalofJilinAgriculturalUniversityTACMR对体外人肺癌细胞NCI-H446、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞SMMC-7721均具有很强的细胞增殖抑制作用，并呈良好的剂量-效应依赖性。TACMR作用于4种不同人肿瘤细胞48h的IC50值分别为38.55，12.08，8.85，7.04μg/mL（图1）。01020304050607080901001.563.136.2512.52550100200NCI-H446SGC-7901SMMC-7721MCF-7浓度/μg•mL-1抑制率%InhibitoryratioConcentration2.2TACMR对H22肝