大鼠局灶性脑缺血脑组织的比较蛋白质组学研究

大鼠局灶性脑缺血脑组织的比较蛋白质组学研究王继生1，邱宗荫*2，夏永鹏2，李惠芝2（1绵阳市第三人民医院绵阳621000；2重庆医科大学药学院重庆400016）[摘要]目的建立局灶性脑缺血模型，从蛋白质整体水平探讨脑缺血/再灌注的保护作用机制。方法雄性、健康大鼠SD，随机分为正常组、脑缺血模型组参照Koizumi法并加以改进，建立MCAO大鼠脑缺血2h再灌注24h的模型；裂解液提取总蛋白质，以双向电泳技术进行蛋白质分离，考马斯亮蓝染色，获得双向电泳图谱，利用专门的软件筛选出差异蛋白质，用MALDI-TOF-MS获得肽指纹图谱，MS-Fit数据库进行搜索，获得有关的蛋白质信息。结果：局灶性脑缺血模型组与正常组脑组织的比较蛋白质组学研究。与模型组比较，从正常组筛选到23个差异表达蛋白斑点，其中13个低表达，10个高表达，鉴定其中6个蛋白质，发现白细胞三烯A-4水解酶、促甲状腺激素释放激素降解胞外酶等与脑缺血相关的蛋白质。结论：从蛋白质组学角度发现了一些与脑缺血相关的蛋白，有助于今后进一步研究脑缺血性损伤的保护机制。[关键词]脑缺血蛋白质组学ACOMPARATIVEPROTEOMESTUDYONFOCALCEREBRALISCHEMICTISSUEOFRATBRAINWangJi-Sheng1,QiuZong-Yin2,XiaYong-Peng2,LiHui-Zhi2(1.Thethirdhospitalofmianyang,mianyang621000;2DepartmentofPharmacy,ChongQingUniversityofMedicalScience.ChongQing400016)[ABSTRACT]Objective:Toestablishamodeloffocalcerebralischemictissueofratbrainandexploretheprotectivemechanismoffocalcerebralischemiareperfusioninwholelevelofproteins.Method:MaleandhealthySDrats,wereclassifiedthemintonormal,Modelatrandom.EstablishedtheMCAOmodelwithsuturemethodbyreperfusion24hafterischemic2haccordingtoKoizumi，smethod,extractedtotalproteinswithLysisbuffer,separatedproteinsbytwo-dimensionalelectrophoresis(2-DE),**绵阳市科委资助课题（编号：06S042-7）作者简介：王继生（1974~），男，药理学博士，研究方向：新药开发的药理学研究及蛋白质组学，Email：[e-mail]assiebrilliantblue,gotthepatterns,foundoutdifferentialproteins,andobtainedPMSbyMALDI-TOF-MS,gainedrelatedtheinformationofproteinsbyMS-Fitdatabase.Result:.Acomparativeproteomestudyofmodelandnormalgroup.Comparedwithmodelgroup,thenormalgroupgained23differentialproteinspots,13spotsexpressedlowly,and10spotshigh,identified6proteinspots，foundouttherelativecerebralischemicproteinssuchasLeukotrieneA-4hydrolase，Thyrotropin-releasinghormone-degradingectoenzymeetc.Conclusion:Establishinga2-DEtechnologywasappliedtoproteinanalysisofbraintissue,andfoundouttherelativeproteinsoffromproteomeaspect.Thiswouldprofitfromtheprotectivemechanismofcerebralischemictissue.[KEYWORDS]：cerebralischemic;Proteomics；脑血管病是危害人类生命与健康的常见病和多发病，以其高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率严重危害人类的健康。脑血管病中尤以脑缺血多见，它是指脑循环血流量减少为特征的中枢神经系统疾病，是中老年人常见病。脑缺血损伤的机制十分复杂[1]，目前有关脑缺血损伤的机制有钙超载，细胞凋亡，自由基，兴奋性递质等，这些研究尚不能完全阐明缺血及再灌注损伤的机制。在大脑损伤中，大量的局部缺血的脑梗塞，是一种血液供给损失行为，在相关的病例中水肿，颅内高血压和死亡占了80%[2]。大脑中动脉（Middlecerebralartery，MCA）供血区是临床上缺血性脑血管病的多发部位，大脑中动脉阻塞(Middlecerebralarteryocclusion,MCAO）模型被认为是局灶性脑缺血的标准动物模型，该模型制备，具有方法简便，不改变大鼠颅内压，缺血时间可控的优点，可以模拟临床上的脑缺血，适用于缺血/再灌注损伤机制和保护大脑的药物研究，以及脑梗死缺血的病理生理研究等。蛋白质是生物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者，蛋白质不仅是多种致病因子对机体作用重要的靶分子，而且也成为大多数药物的药靶乃至直接的药物。蛋白质组学是近年来新兴的、最具潜力的发现药靶的技术平台。蛋白质组(proteome)源于蛋白质(protein)与基因组(genome)两个英文单词的组合，于1994年由两位澳大利亚科学家Wilkins和Williams提出，它指细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式，后引申为一种基因组所表达的全套蛋白质，而一种基因组可包括一种细胞乃至一种生物。近年来，以双向电泳(Two-dimensionalelectrophoresis，2-DG)为核心的蛋白质分离技术和以质谱方法为主的蛋白质鉴定技术等体系已基本成熟[3，4]。本课题采用比较蛋白质组学研究策略，对局灶性脑缺血模型大鼠的脑组织进行研究。以双向电泳为分离手段，以基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）为检测手段；利用生物信息学对所得实验结果进行解析，从而获取健康、病状态下脑组织蛋白质组表达的差异数据，以探讨脑缺血的保护机制。材料与方法一实验设备2K15低温离心机SigmaCo.German;UV-1601型紫外分光光度仪Shimadzu（岛津）Japan;pHS-2型酸度计（精度0.02pH）上海第二分析仪器厂;自动双重纯水蒸馏器（SZ-93）上海亚荣生化仪器厂;VoyagerDEPro基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）美国ABI公司;VIRTIS型冷冻干燥机为VIRTIS公司产品。二主要试剂乙腈（ACN）为Fisher公司产品，三氟醋酸（TFA）为Fluka公司产品，测序级胰蛋白酶（Promegasepuencinggrademodifiedtrypsin）为Promega公司产品，质谱外标混合液Mixture2[包括以下片段：AngiotensinI1297.51;ACTH(1-17)2094.46;ACTH(18-39)2466.72;ACTH(7-38)3660.19;insulin5734.59(+1),2867.80(+2)]、α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamicacid）为Sigma公司产品。三实验方法1实验动物成年健康雄性SD大鼠，体重250～300g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。合格证号：SCXK（渝）2001003，清洁级。实验过程中的动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。2大鼠大脑中动脉局灶脑缺血/再灌注模型制备[4]。将大鼠用3.5%水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉，仰位固定后手术。颈正中切口，长约3cm，锐钝结合分离颈部筋膜，向外牵引胸锁乳突肌，离断二腹肌，打开颈动脉鞘，暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）；由CCA分叉处向头端依次游离，电凝ECA所有分支，在甲状腺上动脉远端结扎、切断ECA，使其主干游离备用；用蛙心夹暂时夹闭CCA和ICA，用剪刀在ECA残端作一环形切口，将预先制备好的头端涂有聚氨酯的尼龙线插入ICA（涂有肝素），缚紧ECA残端丝线以防线栓滑出和出血，移去蛙心夹将线栓缓慢沿ICA入颅方向推进，推进约1.7-2.0cm时感到阻力，表明线栓已经通过大脑中动脉的起始部，完成一侧大脑中动脉的阻塞；松开夹闭CCA的蛙心夹，清理术野，全层缝合，关闭切口；大脑中动脉阻塞2h后打开手术切口，轻轻拔出线栓，微感阻力时停止，实现再灌注，清理术野，关闭切口。假手术组除不插线外，其余步骤同上，再灌注24h。3实验分组。Wistar大鼠雄性12只，实验动物随机分为2组：缺血组，对照组。4取材在脑缺血2h再灌注24h点用3.5%水合氯醛麻醉大鼠后，断头取脑，冰盘中取缺血区脑组织，称重，液氮冻存。5蛋白质含量测定采用Bradford法进行蛋白质定量[5]。以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白，配成浓度为1μg.μL-1的溶液。分别取10、20、40、60、80、100μL标准蛋白溶液。加入不同试管，定容至100μL。各管分别加入5mLBradford工作液：0.01%考马斯亮蓝G-250、4.7%乙醇(v/v)、8.5%磷酸(v/v)充分混匀,放置5min,于570nm处测吸光度，20min内测完。以蛋白浓度为横坐标（x,μg/μL），吸光度为纵坐标（y,OD595nm），作标准曲线，获得线性方程;测出待测样品的595nm处吸光度值6蛋白质双向电泳分离及凝胶染色主要参考BIO-RADPROTEANIEFcell型等电聚焦仪操作指南进行。本实验采用固相IPG预制的线性17cm干胶条（pH3-10，L）。取正常大鼠脑组织样品与缺血脑组织各3份，分别上样。蛋白质上样量为2mg，并使水化上样缓冲液和样品总体积为400μl，进行电泳。电泳结束后，在固定液中固定，经染色液染色，然后在脱色液中脱色，直至凝胶背景变为无色。7图象分析AmershamImageMasterVDS-CL型凝胶成像系统对考马斯亮蓝R-250染色的2-DE胶进行扫描，ImageMaster2DV2002.1图像分析软件产生光密度图像（makeODimage），随后进行蛋白斑点检测，凝胶匹配，根据NormalisedVolume值的变化来判断蛋白斑点表达量的变化，选取部分差异表达候选蛋白作MALDI-TOF质谱分析。8蛋白质鉴定方法本课题蛋白质鉴定使用的是PMF法，蛋白质从二维电泳凝胶上切下，经胰蛋白酶胶内酶解，质谱分析得到肽指纹图谱，然后在互联网上进行肽指纹图谱的比对鉴定。8.1蛋白质的胶内酶解从2-DE凝胶上切下蛋白斑点，切碎成1mm3装入200l的EP管中，水洗三次。用50％ACN/25mM碳酸氢铵400l（pH8.0）脱色15min。反复三次，直至颜色脱尽。胶块浸入100％ACN（ACN中不能有酸性物质）中5min，脱水，胶块变白，室温抽干。加10～15lTrypsin酶液（Promegasequencinggrademodifiedtrypsin,浓度为10～15gtrypsin/mL，用25mMpH8.0的NH4HCO3溶液配制）覆盖胶块，4℃放置60min，胶块吸胀后，吸去多余的酶液，37℃过夜12～15h左右。吸出反应液，加入50％ACN/