国家自然科学基金2

项目类别投送学科代码1科学部编号CC03031102国家自然科学基金申请书项目名称：口腔癌肺高转移相关抗原基因的筛选及其核酸疫苗的研究申请者：所在单位：邮政编码：通讯地址：电话：传真：申请日期：国家自然科学基金委员会填报说明一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原件），由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委一份原件。三、封面上右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和申报学科代码1由申请者填写。四、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数(不含重点项目、重大项目)，不得超过两项。五、同一申请者研究内容相近的项目，只允许报送一个科学部。六、申请者可因同类项目竞争等原因,提出不宜评议本项目的专家名单（姓名与单位，3人以内）,附另页于申请书原件中，供科学部选择同行评议人时参考。科学部将对此信息保密。七、国家自然科学基金委员会通信地址:北京海淀区花园北路35号东门邮政编码：100083－1－一、简表名中文口腔癌肺高转移相关抗原基因的筛选及其核酸疫苗的研究研称英文Screenandnucleicacidimmunizationoflunghighlymetastaticrelatedantigengeneinoralcancerccancercancer究类别A.自由申请B.高技术探索C.青年D.地区E重大F.重点H.专项AAAC高技术探索项目主题号项申报名称1口腔颌面外科学名称2A.基础研究目学科代码1C03031102代码2B.应用基础B申请金额所用实验室姓中文名拼音申请专业技术职务名称代码所名称者在单性质位所在地总人数6主姓名签字项要何荣根成陈万涛邓永强目员林李嵩周晓健组不含申－2－研究内容和意义摘要采用生物芯片技术,对人腺样囊性癌的肺低转移细胞系及其高转移克隆株进行大规模的基因表达定量对比分析,筛选鉴定肺高转移相关抗原基因,设计构建同源的核酸疫苗,建立动物模型,运用分子外科转基因技术将核酸疫苗导入动物模型中,分析其抗肿瘤免疫效果,进一步阐明恶性肿瘤的肺转移机理,寻找新的有效靶位点,为防治癌转移提供新方法。主题词1.主题词数量不多于3个；2.主题词之间空一格（英文用/分隔）中文肿瘤转移基因英文tumor/metastasis/gene简表填写要求一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新发布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。高技术探索课题主题号按《高技术新概念新构思课题项目指南》中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。二、凡选择性栏目,将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称──应确切反映研究内容和范围,最多不能超过25个汉字(包括标点符号)。基础研究──指以认识自然现象、探索自然规律为目的的,不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究──指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。报审学科──申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个,先填为主学科。申请金额──以万元为单位,用阿拉伯数字表示,注意小数点。起止年月──起始时间从申请的次年的1月算起。完成时间为完成年度的12月。所用的实验室──系指研究项目将利用的实验室,仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。所在单位名称及代码──按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填写“中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字,一律写中文，例如：航空航天工业部七O一研究所。首次申请国家自然科学基金的单位,尚未编入单位代码,其代码暂不填。参加单位数──指研究项目组成员所在单位数,包括主持单位和合作单位,以阿拉伯数字表示。项目组主要成员──指在项目组内对学术思想、技术路线的制定与理论分析及对项目的完成起主要作用的人员。本栏双线右侧内容不输入计算机。研究内容和意义──摘要与主题词均录入软盘。－3－二、立论依据(包括项目的研究意义、国内外研究现状分析,并附主要的参考文献及出处)对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合科学前沿，围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。项目的科学意义恶性肿瘤肺转移的防治是临床上进一步提高患者生存率和治愈率的关键所在，具备肺转移潜能的癌细胞亚群是肿瘤组织与宿主组织之间长期相互作用、相互选择的结果,在此过程中,这些癌细胞亚群产生了不同于其它亚群的特点,包括转移相关基因及由其所决定的细胞和群体水平的特点,其中，肺高转移相关抗原基因是一个相当重要的方面[1]，因而，筛选和鉴定肺高转移相关抗原基因，有助于深入理解和阐明肺转移的机制。在此基础上，设计和构建有效的核酸疫苗，发展紧密结合临床实际的转染方法，激活机体的特异性主动免疫，必将对杀伤肺高转移性癌细胞亚群，进而控制肺转移有十分重要的意义。国内外研究现状分析迄今为止,与口腔癌侵袭转移相关的基因只局限在P53`C-erB-2`nm23等少数几个基因上[2],其根本原因在于以往的研究方法受到分子生物学技术的极大限制,只能研究单个或少数几个基因。1996年,在人类基因组计划的研究中，StevenFodor等[3]充分结合并灵活运用了计算机、DNA合成、探针杂交、照相平板印刷、激光共聚焦扫描等技术,创造了完整的DNA生物芯片,可同时定量检测成千上万个基因的表达谱,结合生物信息学可从整体上分析疾病。1998年，Gress等[4]采用含20,736个基因片段的DNA芯片,检查了胰腺癌细胞株、胰腺癌组织与对照胰腺组织的基因表达谱,发现胰腺癌存在129个新基因序列和97个EST,从而找出了形成胰腺癌恶性表型的相关基因。现阶段，国内已建立DNA生物芯片技术和人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移克隆株ACC-M[5]，我们采用含14，000个基因片段的DNA生物芯片首次对遗传背景相同而生物学行为不同的ACC-2和ACC-M进行了大规模的基因表达定量对比分析，结果表明，低转移性的ACC－2细胞系和肺高转移性的ACC－M细胞株比较，有显著差异的基因36个，有差异的基因213个。这些基因涉及跨膜蛋白、细胞信号传导、细胞代谢过程等诸方面。其中的肺高转移相关抗原基因可通过生物信息学分析、反义核酸、血小板凝集试验和裸小鼠移植瘤肺转移模型来筛选和鉴定。对肿瘤抗原加工递呈过程和机体免疫反应的深入研究表明,影响肿瘤免疫治疗效果不理想的重要原因在于肿瘤相关抗原是正常细胞中有或曾经有表达的蛋白质,只是在肿瘤细胞中有不适当的表达,因而引起了机体的免疫耐受,为了克服免疫耐受,1998年Disis等[6]采用同源的人HER-2/neu蛋白免疫小鼠,诱导了比使用小鼠自身neu蛋白大得多的机体免疫。同时发现不使用完整的肿瘤抗原,而只使用肿瘤抗原多肽片段,能更有效地诱发机体免疫反应。但以上研究均采用的是肽疫苗，近年来发展的核酸疫苗因安全、热稳定和能引发持久的细胞和体液免疫等特点,从而比肽疫苗更具发展潜力[7]。－4－核酸疫苗集中了减毒疫苗和亚单位疫苗的优点,既可以不断表达抗原蛋白,又可以克隆所需基因片段,以激发理想的免疫反应,国内外对以T细胞识别的肿瘤抗原为中心的抗肿瘤核酸疫苗免疫治疗进行了大量的研究[8.9],表明能诱发机体的抗肿瘤免疫反应,杀伤癌细胞。但目前关于肺转移相关抗原核酸疫苗的研究尚未见报道。本研究在筛选鉴定肺高转移相关抗原基因的基础上，设计构建同源的核酸疫苗，建立癌细胞动物模型，采用已建立的紧密结合临床实际的分子外科转基因方法，研究其抗肿瘤效果，将对深入理解肺转移的机制和临床外科治疗模式的发展产生积极影响[10]。参考文献1.Resser-JR;Carbone-DP.Immunotherapyofheadandneckcancer.Curr-Opin-Oncol.1998May;10(3):226-322Clayman-GL;Frank-DK;etalAdenovirus-mediatedwild-typep53genetransferasasurgicaladjuvantinadvancedheadandneckcancers.Clin-Cancer-Res.1999Jul;5(7):268-2713.Strachan.T,Abitbol.M,etal.Anewdimensionforthehumangenomeproject:towardscomprehensivemaps.NatureGenetic.1997,16;126-1314.GressTM,Muller-PillaschF,etal.Apancreaticcancer-specificexpressionprofile.Oncogene,1998,13:1819-18305.关晓峰,邱蔚六等.肺高转移性腺样囊性癌细胞株的筛选.中华口腔医学杂志,1996;2:74-77.6.M.L.Disis,F.Mshiotaetbal.HumanHER-2/neuproteinimmunizationcircumventstolerancetoratneu:avaccinestrategyforselftumorantigens.Immunology.1998,93:192-199.7.Seder,RobertA.;Gurunathan,Sanjay.DNAVaccines:DesignerVaccinesforthe21stCenturyTheNewEnglandJournalofMedicine.1999;341(4):277-2798.CiernikIF,BerzofskyJAetal.InductionofcytotoxicTlymphocytesandantitumorimmunitywithDNAvaccinesexpressingsingleTcellepitops.JImmunol1996,156:2369-23759.GaryL.Clayman,AdelK.EI-naggaretalInvivomoleculartherapywithp53adenovirusformicroscopicresidualheadandnecksquamouscarcinoma.CancerResearch,1995;55:1-6.10.JackA.Roth.Molecularsurgeryforcancer.ArchSurg.1992;127:1298-1302.－5－三、研究方案1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标:已建立人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移性克隆株ACC-M,采用DNA生物芯片技术对这两个遗传背景相同而生物学行为不同的癌细胞系的基因表达谱进行定量对比扫描，运用生物信息学、反义核酸技术、分子杂交来筛选鉴定肺高转移相关抗原基因，同时建立癌细胞动物模型，设计构建与口腔癌肺高转移相关抗原基因序列同源的核酸疫苗，采用已建立的紧密结合临床实际的分子外科转基因方法，深入研究其抗肿瘤免疫效果。研究内容1.运用DNA生物芯片技术（含14，000个基因）对腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移性克隆株ACC-M进行大规模的基因表达谱定量对比分析。2.结合生物信息学的聚类分析和同源分析、反义核酸技术、血小板凝集试验、裸小鼠移植瘤肺转移模型来筛选鉴定肺高转移相关抗原基因,通过RT-PCR和分子杂交进一步在临床手术标本和其它口腔癌细胞系中确证.3.选用含巨细胞病毒（CMV）