天然药化实验指导书

《天然药物化学实验》课程课程编号：0741532016实验指导书主撰人解军波审核人天津商业大学生物技术与食品科学学院二零零九年十月前言1．实验总体目标天然药物是人类防病治病药物的一个重要来源。提取、分离天然药物中具有生理活性的化学成分，是天然药物化学研究的一个重要课题。天然药物化学实验主要是学习天然药物有效成分的提取、分离、纯化、鉴定的方法。通过实验，加深学生对理论知识的深入理解，训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力，为将来从事相关研究打下坚实的实践基础。⒉适用专业年级制药工程专业三年级（第五学期）⒊先修课程分析化学、有机化学⒋实验课时分配实验项目实验要求实验类型每组人数实验学时实验一芦丁的提取、分离与鉴定提取、分离与鉴定芦综合74实验二汉防己生物碱的提取、分离、鉴定提取、分离、鉴定汉防己生物碱验证76实验三甘草酸的制备与鉴定分离、鉴定甘草酸验证77⒌实验环境实验室的标准温度为20℃,实验室内的相对湿度一般应保持在50－70％。实验室的噪音、防震、防尘、防腐蚀等方面的环境条件应符合在室内开展的检定项目之检定规程。⒍实验总体要求提取、分离、纯化、鉴定是贯穿于天然药物化学实验的全过程的基本操作单元。正确掌握和灵活处理各个环节的操作技能是训练学生严格认真的科学态度与良好工作习惯，促进理论与实践结合的一个重要环节。通过本实验让学生掌握、熟悉天然药物化学提取、分离、鉴识技术的基本原理与基本方法，能够进行日常的天然药物研究工作。⒎本实验的重点、难点及教学方法建议为了保证实验的正常进行和培养学生良好的实验作风及保证实验质量，学生必须遵守下列要求：1、实验前必须充分预习实验讲义，明确实验目的、要求，防止实验盲目性，讲求实验质量。2、实验时要严格按照规范操作进行，仔细观察实验现象，认真记录有关数据。要善于思考，学会运用所学理论知识解释实验现象，研究实验中的问题。3、重视安全操作，遵守实验室安全守则，使用易燃、易爆、有毒物品时要小心谨慎，避免事故发生。4、要认真写好实验报告，实验报告要清楚、简练、整洁。目录实验一、芦丁的提取、分离与鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1实验二、汉防己生物碱的提取、分离、鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3实验三、甘草酸的制备与鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．61实验一芦丁的提取、分离与鉴定一、实验目的1了解黄酮类化合物的一般性质。2熟练掌握一些基本技能-回流、抽滤、重结晶等方法。二、实验内容利用常规的提取分离方法从槐米中提取分离芦丁，并进行纯度测定。三、实验要求以学生自主训练为主的开放模式组织教学，让学生复习常规提取、分离方法的操作及其注意事项。四、实验准备复习有机化学中回流、抽滤、重结晶操作的相关步骤和相关事项。五、实验原理、方法和手段1.芦丁：也叫芸香苷（Rutin）淡黄色针状结晶，熔点：含三分子结晶水物174～178C；无水物为188C。不溶于乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出，可溶于浓硫酸和浓盐酸，呈棕黄色，加水稀释复析出。UV：MaxMeOH（nm）259，266sh，299sh，3592.槲皮素（quercetin）黄色结晶，熔点：含二分子结晶水物为313～314C；无水物为316C。溶解度：乙醇1：290；无水乙醇1：23（沸时）；可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等溶剂；不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚。UV：MaxMeOH（nm）255，269sh，301sh，370六、实验条件恒温水浴锅、微量熔点测定仪、真空干燥箱、真空泵、三用紫外分析仪、层析缸、层析用玻璃毛细管、铺板器、薄层板加热器微量抽滤瓶、烧杯（500mL、50mL）、500mL圆底烧瓶、冷凝管、500mL分液漏斗酒精灯、石棉网、铁架台乙醇、正丁醇、醋酸、盐酸皆为分析纯，AlCl3，芦丁对照品七、实验步骤芦丁提取称取槐米20g，粉碎后，置烧杯中加热水（50C以上）200mL，煮沸30分钟2（注意补充部分蒸馏水），趁热过滤，滤渣再用50mL2煮两次，每次10分钟，合并滤液，放置使析出沉淀，然后抽滤，并用少量水洗涤2～3次，得芦丁粗品。芦丁精制取芦丁粗品置500mL圆底烧瓶中，加95%乙醇80mL，水浴上温热5分钟，溶解后加活性炭0.1g（先溶解芦丁后再加），接上冷凝管，在水浴上加热，煮沸10分钟，趁热过滤于另一圆底烧瓶中，得黄色澄明溶液，然后回收乙醇，使溶液剩约5～10mL时停止，倾入小烧杯中，以少量95%乙醇洗涤圆底烧瓶，将洗涤液合并于小烧杯中，使结晶尽量析出，然后过滤，得芦丁精品，称重，计算产率。芦丁熔点的测定取芦丁精品0.5g，置真空干燥箱中（80C）干燥30分钟，在微量熔点测定仪上测定熔点。八、思考题黄酮类化合物有哪些提取方法？芦丁的提取还有什么方法？九、实验报告认真写好实验报告，实验报告要清楚、简练、整洁，数据处理符合分析要求。内容包括：实验名称、目的要求、实验原理、仪器与试药、操作步骤、实验结果、讨论。十、注意事项及其它说明（1）.所有实验用水均指蒸馏水。（2）实验中所用易燃有机溶剂，在需要加热时必须用水浴，且注意防火。（3）.槐米的水提液过滤时，必须加适量棉花吸附黏液质，否则将给下一步抽滤造成困难，亦可先倾掉上清液。3实验二汉防己生物碱的提取、分离、鉴定一、实验目的1掌握亲脂性生物碱与水溶性生物碱的分离、纯化方法。2熟悉生物碱的检识和鉴定方法。3熟悉用硅胶柱层析分离汉防己乙素。二、实验内容从粉防己中提取、分离鉴定粉防己碱。三、实验要求以学生自主训练为主的开放模式组织教学，让学生熟悉生物碱的提取、分离、鉴别方法的操作及其注意事项。四、实验准备预习生物碱的结构、基本理化性质和提取分离方法等相关知识。五、实验原理、方法和手段汉防己又名粉防己，为防己科植物粉防己（StephaniatetrandraS.Moder）的干燥根，是一退热镇痛药物，目前该药研究日益广泛。临床上该药除用作治疗神经痛、关节炎、高血压、抗阿米巴原虫外，近来粉防己生物碱的碘甲基或溴甲基化合物已被广泛应用于肌肉松弛剂。汉防己的有效成分是生物碱，总碱含量为1～2%，其中主要的是汉防己甲素、汉防己乙素和少量的水溶性季铵生物碱-轮环藤酚碱和木兰花碱。甲素具有抗风湿及镇痛作用。1.汉防己甲素（tetrandrine）本品为无色针状结晶，不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿和苯。熔点：217～218C，有双熔点现象。自丙酮中结晶者105C左右熔化后加热又固化，至217～218C复熔。UV：MaxMeOH（nm）280IR：maxKBr（cm-1）：3050、2800、1605、1580、1500、1235、1215、8402.汉防己乙素（demethyltetrandrinefungchinoline）本品为无色针状结晶，不溶于水和苯，易溶于氯仿，溶于甲醇、乙醇。溶解度与汉防己甲素相似，极性较汉防己甲素稍高，故在苯中溶解度小，而在乙醇溶解度大于汉防己乙素，借此可以将二者分离。汉防己乙素同样具有双熔点现象，熔点因结晶时所用溶剂不同而不同。丙酮中结晶者：熔点：134～136C。甲醇中结晶者：熔点：177～179C。六、实验条件1.恒温水浴锅、真空干燥箱、真空泵、三用紫外分析仪、层析缸、层析用玻璃毛细管、铺板器、比重计、薄层板加热器、层析柱2.微量抽滤瓶、烧杯（500mL、50mL）、500mL圆底烧瓶、冷凝管、500mL分液漏斗、4表面皿、三角瓶3.普通滤纸、层析用硅胶、薄层层析用硅胶G、CMC-Na、无水Na2SO44.甲醇、乙醇、丙酮、盐酸、氨水、氯仿皆为分析纯，碘化铋钾试剂5.汉防己甲素、汉防己乙素对照品七、实验步骤（一）总生物碱的提取取粉防己300g，用95%乙醇回流提取一次（800mL95%乙醇加2mL浓盐酸回流1小时），四层纱布过滤，合并提取液，减压回收乙醇至小体积，移入蒸发器中水浴浓缩至无醇味，得糖浆状物。（二）分离1亲脂性生物碱与水溶性生物碱的分离在糖浆状物加入3.6%的盐酸约50mL，充分搅拌使生物碱溶解，放置过滤，滤渣用酸水洗涤数次（10mL2）后弃去。（留酸水液5mL，供鉴定用）合并酸液后移至500mL分液漏斗中，加入80氯仿，再滴加浓氨水调PH为9～10，振摇萃取，分取氯仿层。碱水层再以新氯仿萃取（40mL），合并氯仿液即亲脂性生物碱的提取液；碱水层则为水溶性生物碱提取液。（三）生物碱的鉴定薄层层析硅胶G-CMC-Na板展开剂：氯仿：丙酮：氨水=5：4：2～3滴显色剂：碘化铋钾对照品：汉防己甲素、乙素乙醇溶液（0.1mg/ml）样品：总防己提取液、酸水液、碱水液点样量：10微升八、思考题1粉防己中含有哪些主要成分？2糖浆状物中加入3.6%的盐酸的目的何在？3用1%NaOH萃取的目的何在？4为什么用水洗至中性？九、实验报告认真写好实验报告，实验报告要清楚、简练、整洁，数据处理符合分析要求。内容包括：实验名称、目的要求、实验原理、仪器与试药、操作步骤、实验结果、讨论。5实验三甘草酸的制备与鉴定一、实验目的1、掌握高速逆流色谱分离纯化的原理2、熟悉高速逆流色谱、中压制备色谱的操作方法二、实验内容利用高速逆流色谱等方法制备甘草酸，并进行鉴别。三、实验要求以学生自主训练为主的开放模式组织教学，让学生熟悉高速逆流色谱的操作及其注意事项。四、实验准备复习天然药物化学中的相关知识，预习相关方法和相关事项。五、实验原理、方法和手段1、HSCCC利用了一种特殊的流体动力学(单向流体动力学平衡)现象。其原理是基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数。与其他柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形施尾等缺点。2、甘草酸：本品为白色粉末，有甜味。分子式及分子量：C42H62O16822.92。熔点220℃,有特殊甜味,,溶于热水和热的稀乙醇,不溶于无水乙醇。六、实验条件TBE-300A型高速逆流色谱仪系统、中压色谱系统、旋转蒸发器、真空泵、真空干燥箱、熔点测定仪分液漏斗、烧杯、表面皿反相硅胶（SP-120-40/60-ODS-B）、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、盐酸、氨水皆为分析纯，蒸馏水、甘草药材甘草酸对照品6七、实验步骤1甘草酸粗提物的制备：取甘草药材100g，粉碎，过筛（40目），用95﹪乙醇（1：4）超声提取三次，每次45分钟。合并提取液减压抽滤，旋转蒸发仪浓缩得褐色浸膏。在浸膏中加2﹪NaOH溶解，过滤，滤液用2﹪HCl酸化至不再有沉淀生成，过滤，滤渣用冰水洗涤后用真空干燥器在50℃下干燥，得甘草酸粗品。2高速逆流色谱分离：2.1供试液的制备：精密称取甘草酸粗品100mg，溶解于10ml乙酸乙酯-正丁醇-水（5：1.5：5）上层溶液中。2.2分离纯化：将供试液注于色谱仪中，收集相应部位，回收溶剂，得纯度较高的甘草酸。分离条件如下：固定相乙酸乙酯-正丁醇-水（5：1.5：5）（氨水适量）流动相乙酸乙酯-正丁醇-水（5：1.5：5）（氨水适量）流速1.5ml/min转速1000rpm温度25℃检测波长254nm3中压色谱分离：3.1装柱取反相硅胶500g,于105℃活化2h后，取出放置室温即可装柱。柱子采用干法填充，填满整个柱体，不留死体积。3.2取第3步所得甘草酸，取10ml丙酮溶解，上样，泵人中压柱柱头，以甲醇-水（50：50），25ml／min的流速进行洗脱，254nm波长检测，收集相应部位，真空干燥，得甘草酸纯品。4测定紫外图谱，鉴定。八、思考题1高速逆流色谱选用分离溶剂体系的原则是什么？2天然产物的纯度测定常用的方法？九、实验报告认真写好实验报告，实验报告要清楚、简练、整洁，数据处理符合分析要求。内容包括：实验名称、目的要求、实验原理、仪器与试药、操作