土壤洗涤法提高DNA回收率

LOGO土壤洗涤法提高DNA回收率LOGOContents背景及目的1实验方法23分析讨论4实验结果LOGO土壤洗涤法的背景及简介LOGO一、背景及目的从海洋环境样品中提取复杂、非可培养群落进行分析需要有良好的DNA提取和纯化方法。高品质的DNA是当今许多的尖端分子生物技术的基本要求。从复杂的环境如土壤、沉积物、污泥及水中直接提取DNA，通常会导致其他组分共同萃取，如腐殖酸和富里酸。LOGO腐殖酸和黄腐酸腐殖酸和黄腐酸是从植物、动物和微生物的遗体中分离出的土壤有机质经缩聚形成的。腐殖酸和富里酸是三维结构，有能力将其它化合物结合到其功能团上，并且能吸收水分、离子和有机分子。LOGO几乎所有天然有机化合物和许多人工化学物质可以结合或吸收腐殖质。据报告得知，腐殖酸和富里酸能干扰限制性内切酶，DNA转化酶，降低DNA-DNA杂交的效率，抑制Taq聚合酶活性。对后续基因相关工作影响很大。LOGO自然栖息地的微生物多样性研究往往需要从污染环境中提取DNA。有毒、有害的有机污染物和重金属的存在下，通过抑制直接裂解法中使用的酶，可能会很大程度上干扰环境样品中的DNA回收率。LOGODNA提取物中有机污染物和重金属产生的痕迹也可以通过降解或捕获核酸或灭活DNA聚合酶来降低PCR的效率。同样，从环境资源中回收的DNA污染物痕迹可能会严重影响芯片杂交特异性和以微阵列为基础研究功能基因组的有效性。LOGO受污染土壤和底泥的修复往往取决于来自土壤表面和进入水相污染物体中污染物的解吸度。大多数的有机和无机污染物有一种倾向，通过化学或物理方法结合到粘土和泥沙颗粒上。例如，疏水性有机污染物，如多环芳香烃（PAHs）均表现强烈的吸附性。同样，经常发现重金属如铜（Cu）和铅（Pb）结合到粘土和腐植酸材料上。LOGO土壤清洗技术已被广泛用于治理被可溶性重金属、卤化溶剂、芳烃、燃料油、多氯联苯、氯代酚和农药等污染的土壤。广泛的添加剂可用于溶解土壤中的污染物和重金属。LOGO添加剂包括阳离子、阴离子和非离子表面活性剂，有机和无机酸，氢氧化钠，甲醇。如EDTA螯合剂。非离子表面活性的土壤清洗已被用来加强在工业污染土壤中多环芳烃的生物利用率。已证明EDTA在各种污染土壤中对铅、镉、锌的去除起了重要作用。LOGO在生物修复研究中，土壤经表面活性剂和螯合剂处理，脱附和溶解了杂质，可增加微生物的生物利用率。同样的方式，微生物将利用更多的生物污染物，其机理可能用于在土著土壤DNA的溶解和提取之前消除潜在的干扰物质。LOGO土壤清洗法提取DNA的实验流程LOGO本文所用到的海洋沉积物样品分别采自悉尼港和加拿大新斯科舍省。受悉尼焦油池的污染影响，这些池塘已对人类造成了重大的生态及健康危机，并已被证明难以补救。LOGO1998年，加拿大联邦政府、新斯科舍省政府和布雷顿角市之间的书面协议中，正式认定悉尼焦油池和焦炉地作为集中形成的加拿大最大污染场址。港口沉积物中含有高浓度的多环芳香烃（PAHs）、杂环芳香烃、多氯化联苯（PCB）和重金属如镉（Cd）、汞（Hg）、铅（Pb）和锌（Zn）。LOGO本研究应用土壤清洗法，从被烃污染的潮间带淡水湿地沉积物中或来自SydneyHarbour和NovaScotia.Canada的高度污染的海洋沉积物中提取DNA，进行结果分析，最终对土壤洗涤的影响进行了评价。LOGO实验流程图Phase1Phase2Phase3群落总DNA的提取PCR扩增总群落DNA变性梯度凝胶电泳（DGGE）LOGOPhase1群落总DNA的提取群落总DNA利用不同的方法从沉积物中回收。其中化学裂解法提取过程做两组实验，蛋白质和腐殖酸醋酸铵沉淀和十六烷基甲基溴化铵（CTAB）培养和酚/氯仿提取的比较总DNA的得率。LOGO土壤清洗提取DNA的步骤如下：1、沉积物（5g）先用10ml清洗液1（50mMTris–HClpH8.3,200mMNaCl,5mMNa2EDTA,0.05%TritonX-100）涡旋清洗2min。样品离心3min（3000g）。2、用10ml清洗液2（50mMTris–HClpH8.3，200mMNaCl，5mMNa2EDTA冲去底泥颗粒，离心3min（3000g）。EDTANa2EDTANa2EDTANa2EDTANa2LOGO3、用10ml清洗液3(10mMTris–HClpH8.3，0.1mMNa2EDTA)冲洗沉积物去除PCR抑制剂。离心3min（3000g）。注：用不同浓度的EDTA缓冲液连续清洗被用来溶解沉积物中的重金属、污染物和PCR直接抑制物。先完成的初洗之后得知，微生物碎片不能从沉积物中脱离。LOGO4、用常规化学裂解法提取总DNA。在此步中，蛋白酶K最终浓度增加至200ug/ml。5、在蛋白质醋酸铵沉淀之前，上清液一分为二（2.5ml/样品），并采用CTAB法或醋酸铵法进一步纯化。LOGO（1）CTAB法步骤：先加5MNaCl（终浓度为0.7M），然后加CTAB（0.7MNaCl中含有10％CTAB）至终浓度达到0.7MNaCl中含有1％CTAB。样品65℃孵育10min，用1体积苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）提取，然后在室温离心（4000g）10min。样品经氯仿：异戊醇（24:1）提取，离心3min（3000g）。LOGO（2）醋酸铵法：用预冷的异丙醇沉淀DNA，再用300ulTE(10mMTris–HClpH8.0；0.1mMNa2EDTA)悬浮。6、每次提取物处理，使用由Berthelet等人介绍的polyvinylpolypyrrolidone离心柱去除腐殖酸的痕迹。LOGO取5ul纯化DNA加样到0.7％琼脂糖凝胶上，用HindIII酶切消化的lambdaDNA作为分子量标记（GibcoBRL），溴化乙锭染色观察。在大多数情况下，DNA提取实验要重复使用独立分离得样本。LOGOPhase2PCR扩增总群落DNA引物互补的16SrDNA保守区被用来扩增418bp片段，相当于大肠杆菌序列中341到758的位点。正向引物序列包含一个GC夹，来稳定扩增片段的熔融行为）。带有夹具的正向引物序列（下划线）是：5’GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG–3’。反向引物序列为：5’CTACCAGGGTATCTAATCC–3’。LOGOPCR体系及循环条件：ComponentVolumeDilutedtemplateDNA1.0mLPrimer1(25ng/mL)1.0mLPrimer2(25ng/mL)1.0mLdNTP(2.5mM)6.0mL10xPCR-buffer(containingMgCl2)5.0mLTaqDNApolymerase(5U/mL)0.5mLSDW35.5mLTotalvolume50.0mL降落PCR反应循环条件如下：96℃预变性5min94℃变性60s65℃退火60s10个循环72℃延伸3minDEC=1℃94℃变性60s55℃退火60s20个循环72℃延伸3min10℃保存。为了提高扩增的特异性和减少杂散副产品的形成，降落PCR（唐等，1991年）中，退火温度设定为65℃和每个循环减少1℃直至降到55℃。LOGOPhase3变性梯度凝胶电泳（DGGE）经PCR获得的16SrDNA用乙醇沉淀浓缩后进行DGGE技术分析:1、PCR产物16SrDNA的每个样本（350或500mg）适用于一线凝胶。DGGE应用了生物拉德Dcode通用突变检测系统（BioRadDcodeUniversalMutationDetectionSystem）。梳子插入过程中为了避免干扰渐变，在6％（w/V）的N，N-亚甲基丙烯酰胺：双丙烯酰胺（37.5:1）浓缩胶中不加入变性剂。LOGO2、凝胶电泳在80v运行16h。电泳后，凝胶在1-TAE中染色30min，其含有1:10000的VistraGreen稀释液，在1×TAE中脱色30min，然后用FluorImager系统模型595可视化分析。LOGO土壤清洗法提取总DNA的实验结果及分析LOGO三、实验结果1、总DNA回收率（1）比较研究Ste.Croix淡水沉积物中总DNA回收率：图1从Ste.Croix收集的沉积物8和10中提取总群落DNA的凝胶电泳图。M:用HindIII酶切消化的LambdaDNA（箭头指示23.1kb片段），E：EDTA清洗，A：乙酸铵,C：CTAB，F：无EDTA的清洗：用PVPP净化。LOGO•所有情况下，在PVPP纯化步骤后都有一小部分的DNA丢失(比较FA与FA*,FC与FC*,EA与EA*，EC与EC*)。•从沉积物中收回更多的DNA，样品10，利用的是硝酸铵和磷酸铵(图1,10FA,10FC,10EAand10EC)。来自沉积物总DNA含量的回收略低于当化学裂解之前纳入EDTA清洗时的情况(图.1,比较FA*toEA*和FC*toEC*)或当CTAB代替醋酸铵时的情况(Fig.1,比较FA*toFC*andEA*toEC*)。LOGO（2）比较悉尼海港的海洋沉积物总DNA回收图2从SydneyHarbour,NovaScotia收集的沉积物14和21中提取总群落DNA的凝胶电泳图。M:用HindIII酶切消化的LambdaDNA（箭头指示23.1kb片段），E：EDTA清洗，A：乙酸铵,C：CTAB，F：无EDTA的清洗。LOGO应用所有方法，只有污染少的沙质沉积物中能成功回收高分子量单一DNA条带，样品21（图2）。EDTA清洗有利于完整基因组DNA的回收，只有一小部分剪切DNA分子产生(Fig.2,comparelanes21EAtoFAand21ECtoFC)。用CTAB代替醋酸铵处理样品21时，总DNA回收量略有减少(Fig.2,comparelanes21EAtoECand21FAtoFC)。LOGO图3.从SydneyHarbour,NovaScotia收集的沉积物14和21中经清洗程序修饰之后提取总群落DNA的凝胶电泳图。清洗液1重复两次（无+号）或清洗液1和3两者同时重复两次（+）。M:用HindIII酶切消化的LambdaDNA（箭头指示23.1kb片段），E：EDTA清洗，A：乙酸铵,C：CTAB。LOGO在污染较严重的粉质底泥中，样品14，只有当化学裂解前纳入EDTA清洗时才能回收高分子量单一DNA条带（图3）。当二次加入清洗液1时，才能从这个样品中获得完整的总DNA(Fig.3,lanes14EAandEC)。当除了二次加入清洗液1，二次加入清洗液3也可以(Fig.3,lanes14EA+andEC+)。LOGO然而，将样品21用清洗液1和清洗液3分别进行第三次清洗后，总DNA回收量明显降低(Fig.3,comparelanes21EAtoEA+and21ECtoEC+)。当在化学裂解步骤中用CTAB法代替醋酸铵法，来自沉积物DNA的回收量也减少(Fig.3,comparelanes14EAtoEC;14EA+toEC+;21EAtoECand21EA+toEC+)。LOGO2、16SrDNA序列的PCR扩增结果（1）比较从Ste.Croix淡水沉积物的16SrDNA序列的PCR扩增图.4.从Ste.Croix收集的沉积物8和10提取总群落DNA经PCR扩增聚集的16SrDNA凝胶电泳图。纯（0），稀释10倍（-1）和100倍（-2）的DNA提取物作为PCR的模板。M:100-bp的DNA片段，E：EDTA清洗，A：乙酸铵,C：CTAB，F：无EDTA的清洗。阴性对照用“-”表示。箭头指示的是500bp分子量片段，星表示扩增的16SrDNA片段。LOGO各种方法回收的群落总DNA的纯度是通过16SrDNA的扩增评估的。总DNA稀释系列（纯，10-1和10-2）用于测试沉积物样品中抑制剂的残余量。忽略提取程序，用纯DNA成功地扩增出16SrDNA（图4）。类似的扩增图谱只有从仅油污染的样本8中获得(Fig.4,compare