土壤生态修复相关酶指标测定

土壤生物化学指标测定土壤脱氢酶(dehydrogenase)活性测定（比色法）（一）分析意义脱氢酶能酶促脱氢反应，它起着氢的中间传递体的作用。在土壤中，碳水化合物和有机酸的脱氢酶作用比较活跃，他们可以作为氢的工体。脱氢酶能自基质中析出氢而进行氧化作用。（二）方法选择与原理Lenhard(1956)最先提出用TTC作为氢的受体生成红色的TF，进行闭塞测定，以溶液的光密度值表示酶活性。后来对上述的方法做了不同的改进和完善。用土壤有机质作为氢的供体或用葡萄糖做氢的供体，用生成的TF数量或换算成氢的体积来表示脱氢酶的活性。（三）试剂配制1、0.5%TTC溶液2、甲苯3、Tris-HCl缓冲液Ph7.6：0.1M三羟甲基氨基甲烷（12.114g/L）50ml与0.1MHCl38.5ml混合后，用水稀释至100ml。4、硫化钠5、0.1mol/L葡萄糖溶液。（四）实验步骤1、标准曲线的绘制：称取相当于50mg纯品量的已烘干的TTC于50ml比色管中，定容，制成1mg/L的母液。分别向6支50ml比色管中依次注入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mLmg/ml标准TTC溶液，用蒸馏水定容至5mL。在试管中依次加入2mLTris-HCl缓冲液，2mL蒸馏水，2mLTTC系列溶液，对照组不加TTC，再各加入1g低亚硫酸钠，摇匀，待溶液充分显色后，各管准确加入5ml甲苯，振荡萃取2min，取上层有机溶液在紫外分光光度计492nm处闭塞绘制标准曲线。2、操作过程：取1g新鲜土壤，置于50ml比色管中，依次加入4mlTris-HCl盐酸缓冲液、2ml0.1mol/L葡萄糖溶液、1ml0.5%TTC溶液,震荡均匀，离心（4000转/分）5分钟后，将甲苯提取液在分光光度计492nm处闭塞测定。同时设无土壤和无TTC的对照（以蒸馏水替代）。3、结果计算：脱氢酶活性=TF含量/0.5g—土壤含水量脱氢酶活性，以24h后1g干土中TF的生成量表示。过氧化氢酶（Catalaseactivity）活性测定（滴定法）1.试剂配制（1）0.3%过氧化氢溶液100mL：取1mL30%的过氧化氢溶液，在100mL容量瓶中定溶至100mL即可。（2）3N硫酸。（3）0.1N高锰酸钾溶液500mL：取7.9015g高锰酸钾溶于蒸馏水中，稀释至500mL，即得0.1N的高锰酸钾溶液。2.操作步骤取2g土壤样品，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢溶液。将三角瓶放在摇床上，振荡20min。而后加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。然后，吸取25mL滤液，用0.1N高锰酸钾溶液滴定至淡粉红色终点，所消耗的高锰酸钾量（mL数）记为B；另取一管不加土样作对照，按上述方法操作，即滴定25mL原始的过氧化氢混合液，所消耗的高锰酸钾量（mL数）记为A。3.结果计算以20min后1g土壤的0.1N高锰酸钾滴定的毫升数表示过氧化氢酶活性。即A-B为过氧化氢酶活性。单位：mgKMnO4·g-1·min-1。土壤脲酶（urease）活性的测定（比色法）（一）分析意义脲酶广泛存在于土壤中，是研究的比较深入的一种土壤酶。脲酶酶促产物————氨是植物氮源之一。尿素氮肥水解于脲酶密切相关。有机肥料中也有游离尿美的存在。同时脲酶与土壤其他因子（有机质含量、微生物数量）有关。研究土壤脲酶转化尿素的作用及其调控技术，对提高尿素氮肥利用率有重要的意义。（二）方法选择及原理脲酶是一种转性较强的酶。它能酶促尿素水解成氨、二氧化碳和水，Rotini(1935)，首先提出研究测定土壤脲酶，研究证明，中型介质中脲酶活性最强。故测定土壤脲酶时，一般采用中性缓冲体系，也有的研究者也用碱性缓冲液测定脲酶。测定土壤脲酶均采用尿素做基质，浓度范围为2——10%。（三）试剂配制1、PH6.7柠檬酸缓冲液：取368g柠檬酸溶于600ml蒸馏水中，另取259g氢氧化钾溶于水，再将二种溶液混合，用1NNaOH讲PH调至6.7，并用水稀释至2L。2、苯酚钠溶液：称62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，然后用乙醇稀释至100ml（A液），保存在冰箱中，称27g氢氧化钠溶于100ml水中（B液），保存在冰箱中，使用前，取A、B两页各20ml混合，并用蒸馏水稀释至100ml备用。（各12ml，混合，稀释至60ml，使用之前混合！）3、次氯酸钠溶液：用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。4、10%尿素液。5、甲苯6、氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于睡并稀释至1000ml，则得1ml含0.1mg氮的标准液，绘制标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。0.1mg/ml（四）实验步骤1、标准曲线的绘制：吸取稀释3倍的标准液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5ml，移于10ml离心管中，然后加蒸馏水至1.5ml。先加2ml苯酚钠溶液，再立即加入1.5ml次氯酸钠溶液，每加入一种试剂后均将混合物仔细混合。20分钟后显色，1h内在分光光度计上于578nm处比色，制作标准曲线。2、操作过程：取相当于1g新鲜土壤置于10ml离心管中，加0.2ml甲苯。15分钟后加2ml10%尿素液和4mlPH6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀封口后在370C恒温箱中培养24h.取出过滤，过滤后取0.6ml滤液注入50ml比色管中，然后先加0.8ml苯酚钠溶液，再立即加入0.6ml次氯酸钠溶液，每加入一种试剂后均将混合物仔细混合。20分钟后显色，1h内在分光光度计上于578nm比色，实验需设无基质对照和无土壤对照，无基质对照用水替代。对照组不加尿素！！！3、结果计算：脲酶活性以24h后1g土壤中氨基氮的含量表示。NH3----N(ug)=a*10/5g—土壤含水量a——测得的氨基氮的含量土壤蔗糖酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）一、原理蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。二、试剂1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876gNa2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯2）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。3）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。三、操作步骤（1）标准曲线绘制分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂1mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长508nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。（2）土壤蔗糖酶测定称取1g土壤，置于50mL三角瓶中，注入3ml8%蔗糖溶液，1mlpH5.5磷酸缓冲液和200μL甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加1mlDNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至7ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色。为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。四、结果计算：蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。蔗糖酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n／ma样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m表示烘干土重土壤酸性磷酸酶活性的测定：①原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即pNPP）为基质，基质在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色色的对硝基苯酚（即pNP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性，采用的是对硝基苯磷酸二钠比色法。②测定方法1.称取1g风干土于10mL离心管中，加入0.2mL甲苯和4mLpH6.5磷酸缓冲液，再加1mL0.05mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液（用磷酸缓冲液配制），摇匀后加盖，放进37℃的培养箱中进行培养1个小时；2.培养完成后取出加入0.5mol/L的CaCl21mL及0.5mol/L的NaOH4mL，摇匀；3.而后在2500r/min下离心5min；取上层清液于10ml离心管4000r/min下再离心5min.取上清液在410nm处比色，并记录吸收光值。③标准曲线的制作①取13支玻璃试管，按顺序编号，并按表2加入试剂。表2对硝基苯酚标准曲线配制表离心管号01234560.5mM00.010.020.030.040.050.06H2O（mL）10.990.980.970.960.950.94pNP含量（mol）00.000050.00010.000150.00020.00250.0003离心管号7891011120.050.070.080.090.100.110.12H2O0.930.920.910.900.890.88pNP含量（mol）0.000350.00040.000450.00050.000550.0006摇匀0.2M磷酸缓冲液（pH6.5）0.5MCaCl20.5MNaOH4mL1mL4mL②混匀后，转入10mL的离心管中，在2500r/min下离心5min，再在4000r/min下离心5min以0号作为对照，在OD410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值OD410。③以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即对硝基苯酚含量n（?mol）=a+b×A410.⑷计算方法土壤酸性磷酸酶的活性用每克土中的对硝基苯酚的微克数表示，即（?g/hgW）=n×M×稀释倍数/（W×t）式中：n—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的浓度（?mol）；M—对硝基苯酚的相对分子质量（为139.11单位是g/mol）；t—反应时间（h）；W—样品土壤的重量（g）土壤多酚氧化酶活力的测定试剂配制（1）1%邻苯三酚溶液（2）乙醚（3）0.5N盐酸（4）重铬酸钾标准溶液——0.75g重铬酸钾溶于1升0.5NHCl(相当于50mI醚中含5mg紫色没食子素)(5)pH4．5柠檬酸——磷酸缓冲液。1.标准曲线的绘制：取重铬酸钾标准溶液，用0.5NHCI稀释成各种不同浓度。定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。以光密度位为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。2.投作步骤取1g土样(过0.25mm筛)，置于50ml三角瓶中，然后注入10ml1％邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30度恒温掐小培养2h。取出后加4mlpH4．5柠檬酸——磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。比色时用波长为430nm的滤光片。为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用元水乙醇洗涤比色液槽一次。为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正。没食子酚的纯度，需设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。在无基质的土壤的对照中，用水代替基质进行培养。3．活性表示紫色没食子索的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线